【摘要】：[目的]:尋找調(diào)控沙眼衣原體GlgA蛋白表達(dá)和分泌的分子機制的同時,利用酵母雙雜交系統(tǒng)從人宮頸癌上皮細(xì)胞cDNA文庫篩選出與GlgA相互作用的分子,為進(jìn)一步研究GlgA的分子功能提供理論基礎(chǔ),也對闡明沙眼衣原體的致病機制提供實驗依據(jù)和新思路。[方法]:(1)分析Ct D型標(biāo)準(zhǔn)株ORFs,給衣原體編碼基因設(shè)計特異性擴(kuò)增引物。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)以獲得目的基因,將構(gòu)建好的PGEX-6P-1/GlgA原核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21,以0.4mM IPTG的濃度條件誘導(dǎo)表達(dá)重組GlgA蛋白。(2)采用SignalP-4.1軟件對GlgA蛋白N端進(jìn)行信號肽預(yù)測分析,并用細(xì)菌分泌蛋白特異性阻斷劑C16和C1化合物分別或同時處理Ct感染的HeLa細(xì)胞,觀察阻斷Ⅱ型、Ⅲ型分泌途徑對GlgA蛋白分泌的影響;經(jīng)新生霉素處理、噬斑篩選及穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),構(gòu)建Ct質(zhì)粒缺失株和缺失互補株,并鑒定質(zhì)粒編碼基因在兩種菌株的缺失及表達(dá)情況;間接免疫熒光法觀察質(zhì)粒缺失對GlgA表達(dá)和分泌的影響。(3)應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選出GlgA的互作蛋白:將GlgA基因cDNA克隆構(gòu)建到酵母雙雜交的誘餌載體上,并對載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增、Sfi I酶切,將得到的克隆片段與酶切后的p GBKT7誘餌載體質(zhì)粒連接,利用PCR法擴(kuò)增質(zhì)粒引物,對重組的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GlgA進(jìn)行酶切與測序鑒定。將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GlgA和pGBKT7空載轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GlgA的毒性檢測和自激活檢測。同時篩選人宮頸癌上皮細(xì)胞cDNA文庫,并純化足夠的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞,把含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GlgA的酵母菌與人宮頸癌上皮細(xì)胞c DNA文庫融合后,將雜交產(chǎn)物分別鋪板于SD/-Trp、SD/-leu、SD/-His、SD/-Ade固體培養(yǎng)平板上,篩選陽性克隆。提取pGBKT7-GlgA質(zhì)粒,對陽性克隆進(jìn)行測序及比對分析。[結(jié)果]:(1)雙酶切及測序的結(jié)果表明GlgA的基因序列正確。純化的GlgA蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE電泳和WB分析,可以發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)的位置有明顯的蛋白條帶,其蛋白分子量與預(yù)期結(jié)果相符。(2)GlgA蛋白N端無信號肽序列,細(xì)菌Ⅱ型、Ⅲ型分泌途徑特異性阻斷劑C16和C1化合物不能阻斷GlgA的胞漿分泌;Ct質(zhì)粒缺失株CTD1的質(zhì)粒編碼基因pgp7丟失,且質(zhì)粒編碼蛋白Pgp3及基因組編碼蛋白GlgA的表達(dá)和分泌現(xiàn)象均消失;Ct缺失互補株CTD1-pGFP::SW2重新獲得pgp7基因,并恢復(fù)Pgp3蛋白和GlgA的表達(dá)和分泌。(3)成功構(gòu)建p GBKT7-Glg A誘餌質(zhì)粒,通過檢測后證明其自身無毒性、自激活能力,并且可以在酵母菌中表達(dá)。誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入文庫后經(jīng)過兩輪篩選,共得到11個陽性克隆。[結(jié)論]:本實驗初步證實Ct糖原合酶GlgA蛋白的表達(dá)和分泌不依賴細(xì)菌Ⅱ型和Ⅲ型分泌途徑,而與衣原體質(zhì)粒密切相關(guān)。同時,以GlgA基因cDNA克隆為誘餌,篩選人類酵母雙雜交文庫,經(jīng)過兩輪文庫篩選后一共篩選到11個初始陽性,對DNA測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析,表明這11個陽性克隆分別編碼4種蛋白,大致分為以下幾類:(1)結(jié)合蛋白類(如CAPG);(2)轉(zhuǎn)錄因子類(如CXXC1);(3)凋亡相關(guān)蛋白類(如腫瘤抑制因子PHB);(4)脂蛋白類(如APOA1BP),它們均有重要的生物學(xué)功能。
【圖文】：

圖 1A SDS—PAGE 分析 GlgA 蛋白表達(dá)的結(jié)果Fig.1ASDS-PAGE analysis of GlgA protein expression1 strain without IPTG at 37℃and 220rpm conditions induced for 6h; 2:BLded with 0.2mM IPTG at 37℃and 220rpm conditions induced for 6h; 3:BL21 swith 0.4mM IPTG at 37℃and 220rpm conditions induced for 6h; 4:BL21 s

BSDS-PAGE分析GlgA蛋白的純化
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R374

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本文編號：2602507