【摘要】：眾所周知,大腦功能的完整在整個(gè)機(jī)體生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用,而大腦的功能與可塑性依賴于在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中建立的復(fù)雜的神經(jīng)回路。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的異常不僅可引起多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如自閉癥、癲癇、亨廷頓舞蹈病、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、智力發(fā)育缺陷、神經(jīng)炎性痛等,與此同時(shí),還會(huì)影響其他多系統(tǒng)的發(fā)育異常及功能障礙,如神經(jīng)內(nèi)分泌功能障礙等。近年來研究表明,遺傳性X染色體連鎖智力發(fā)育缺陷綜合征(X-linked mental retardation,XLMR)與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育障礙有關(guān)。有趣的是,研究者發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子13(Fibroblast growth factor 13,FGF13)在這一遺傳性疾病中發(fā)揮著重要的功能。因此,FGF13在遺傳性X染色體連鎖智力發(fā)育缺陷綜合征這一疾病中的作用被廣泛關(guān)注。成纖維細(xì)胞生長因子同源性因子(Fibroblast growth factor homologous factors,FHFs)家族屬于成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factors,FGFs)家族成員,其成員包括FGF11-FGF14。FHFs與FGFs具有30%-50%的氨基酸序列同源性,但由于其N-末端缺少分泌信號(hào)序列而不能分泌到細(xì)胞外,也不能與FGF受體結(jié)合,因而FHFs可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮與FGFs不同的重要作用。近年來,有關(guān)FHFs在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮的作用受到廣泛關(guān)注。研究表明,FGF12與FGF14的缺陷通過介導(dǎo)電壓依賴性鈉通道(Voltage-Gated Sodium Channels,VGSCs)和電壓依賴性鈣通道(Voltage-Gated Calcium Channels,VGCCs)的異常使得小鼠發(fā)生嚴(yán)重的共濟(jì)失調(diào);FGF12通過調(diào)節(jié)血管平滑肌的表型轉(zhuǎn)化影響血管的舒縮功能;FGF13通過影響神經(jīng)元的發(fā)育和遷移,在遺傳性X染色體連鎖智力發(fā)育缺陷綜合征中發(fā)揮著重要的作用。研究者發(fā)現(xiàn),FGF13的缺陷引起海馬神經(jīng)元的遷移障礙,軸突末端出現(xiàn)多極化現(xiàn)象。另外,谷氨酸受體在海馬神經(jīng)元中高表達(dá),其功能與學(xué)習(xí)記憶有著密切的關(guān)系。依賴于谷氨酸受體的開放所產(chǎn)生的長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation,LTP)被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶行為的機(jī)制。然而,FGF13在XLMR疾病中所發(fā)揮的電生理機(jī)制及其與谷氨酸受體間的聯(lián)系還并不清楚。因此,我們擬在完成海馬CA1區(qū)特異性敲除小鼠的構(gòu)建及行為學(xué)評(píng)價(jià)后,試圖通過FGF13對(duì)海馬神經(jīng)元電生理特性及谷氨酸受體的調(diào)節(jié)作用進(jìn)一步探究其對(duì)XLMR的機(jī)制。第一部分海馬CA1區(qū)特異性敲除FGF13小鼠的構(gòu)建及行為學(xué)的變化目的:使用Cre-loxP重組酶系統(tǒng)特異性敲除海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中的FGF13,研究海馬CA1區(qū)神經(jīng)元FGF13缺陷對(duì)動(dòng)物行為學(xué)的影響。方法:(1)CamKⅡ-Cre小鼠與FGF13-loxP小鼠交配繁殖及基因型鑒定,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)鑒定海馬組織中FGF13敲除效率。(2)應(yīng)用Morris水迷宮(Morris Water Maze),曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open-field Test),高架十字迷宮(Elevated Plus Maze)測(cè)定野生型(Wild type,WT),FGF13敲除小鼠(Knock out,KO)的空間記憶、焦慮及抑郁樣行為。(3)統(tǒng)計(jì)方法:兩樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。結(jié)果:(1)轉(zhuǎn)基因小鼠交配繁殖及基因型鑒定:將CamKⅡ-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與FGF13~(fl/fl)轉(zhuǎn)基因小鼠交配得到CamKⅡ-Cre,FG13~(fl/+)雜合子小鼠后,再與CamKⅡ-Cre,FGF13~(fl/+)雜合子小鼠交配得到CamKⅡ-Cre,FGF13~(fl/fl)小鼠,即海馬CA1區(qū)神經(jīng)元特異性敲除FGF13的轉(zhuǎn)基因小鼠。小鼠新出生后10天左右,用剪腳趾標(biāo)記的方法編號(hào)并剪鼠尾約0.5cm提取基因組DNA,通過PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)目的DNA條帶。CamKⅡ-Cre基因的目的條帶約100bp,FGF13的WT條帶約183 bp,FGF13的Flox條帶(FGF13插入loxP位點(diǎn)的目的條帶)約241 bp。(2)海馬神經(jīng)元FGF13的敲除效率:通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),對(duì)WT組與KO組FGF13的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量。結(jié)果表明FGF13在WT組小鼠海馬神經(jīng)元中有較高水平表達(dá),相比于WT組,KO組小鼠海馬神經(jīng)元中FGF13的表達(dá)量顯著降低。(3)行為學(xué)結(jié)果:與WT組小鼠相比,KO組小鼠在水迷宮中表現(xiàn)出明顯的空間學(xué)習(xí)記憶能力降低,表現(xiàn)為逃逸潛伏期明顯升高,平臺(tái)穿越次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比明顯下降(P0.05),但在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中,中心活動(dòng)時(shí)間百分比、進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù),開臂與閉臂的比值沒有顯著性差異。結(jié)論:FGF13在海馬神經(jīng)元參與的空間學(xué)習(xí)記憶行為中發(fā)揮重要的作用。特異性敲除海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中的FGF13能夠顯著降低小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,但并不影響小鼠的焦慮及抑郁樣行為。第二部分FGF13對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元興奮性的影響目的:應(yīng)用腦片膜片鉗技術(shù)研究FGF13對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元興奮性的作用,探究FGF13對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力影響的電生理機(jī)制。方法:(1)應(yīng)用腦片膜片鉗技術(shù)觀察FGF13對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)作用,如動(dòng)作電位。(2)應(yīng)用qPCR技術(shù)研究FGF13對(duì)海馬神經(jīng)元中谷氨酸受體表達(dá)量的影響。(3)統(tǒng)計(jì)方法:兩樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。結(jié)果:(1)通過Step和Ramp兩種刺激程序?qū)ｑRCA1區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放頻率進(jìn)行分析,結(jié)果提示:與WT組相比,KO組在兩種刺激程序下的動(dòng)作電位發(fā)放頻率顯著降低(P0.05),首次誘發(fā)動(dòng)作電位所需的電流閾值顯著升高(P0.05),靜息膜電位水平無顯著差異。(2)FGF13對(duì)海馬神經(jīng)谷氨酸受體表達(dá)量的影響:與WT組相比,構(gòu)成N-甲基-天冬門氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)的必須亞基GluN1亞基在KO組小鼠中顯著減低(P0.05),與之相反的是,α-氨基羥甲基異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methy,AMPA)的亞基GluA1、GluA3在KO組小鼠中顯著升高(P0.05)。結(jié)論:FGF13的缺陷可以顯著降低動(dòng)作電位的發(fā)放頻率,并降低NMDA受體必須亞基GluN1的表達(dá),升高AMPA受體亞基GluA1、GluA3的表達(dá)。
【圖文】：

圖 1 海馬 CA1 區(qū)特異性 FGF13 敲除鼠的構(gòu)建及敲除效率的檢測(cè)Fig.1 Generation of hippocampal CA1-specific knock out FGF13 mice usingCre-Loxp recombination system(A) A schematic diagram of FGF13 conditional knock out mice. (B) ThePCR images are shown. (C) qPCR analysis to detect the FGF13 mRNA levelin WT and KO mice. (D) qPCR analysis to detect the FGF12A, FGF12B,FGF14A, FGF14B mRNAlevel. (n=4 for WT and KO，*** P ＜ 0.001）

圖 2 FGF13 對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響Fig.2 Effects of FGF13 in learning and memory(A) The average time needed to locate the platform during the trainingsessions. (B) Swimming paths of WT (left) and KO (right) mice during theprobe trial session in the water Morris maze. (C) Target crossing times. (D)Quadrant preference of mice during the 1 min. (E) Swimming speed of WTand KO mice. (n=13 for WT and KO，* P ＜ 0.05，，** P ＜ 0.01）
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R338

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 唐賀;王志華;張永健;張海林;王川;;FHFs在心律失常中作用及機(jī)制的研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2015年01期

2 ;Roles of intracellular fibroblast growth factors in neural development and functions[J];Science China(Life Sciences);2012年12期

本文編號(hào)：2599239