【摘要】：柯薩奇病毒B組5型(Coxsakievirus B5,CVB5)是引起5歲以下嬰幼兒發(fā)病的一種腸道病毒,輕則能夠造成嬰幼兒的手足口病、腹瀉,重則可引起無菌性腦膜炎、心肌炎、I型糖尿病等并發(fā)癥,對全球范圍的嬰幼兒的健康造成了不可估量的威脅。然而,目前并未有有效的治療手段,更沒有疫苗來預防CVB5的感染,因此,CVB5疫苗的研發(fā)刻不容緩。本研究的目的是通過冷適應減毒的方法制備CVB5減毒疫苗,通過動物實驗對其安全性和有效性進行評價。為了獲得CVB5溫度敏感株,我們通過冷適應減毒的方法進行,方法如下:將本實驗室凍存的CVB5病毒液過濾除菌后接種于Vero細胞中,37℃培養(yǎng)1代,即為野毒株,命名JZ-WT;33℃?zhèn)髦?0代,即為溫度敏感株,命名JZ-P50。其中,每10代分別測定33℃和37℃病毒滴度,通過其不同代次不同溫度之間的滴度比較來判定是否為溫度敏感株。JZ-P50溫度敏感株通過制備疫苗來評價其安全性和有效性,方法為將CVB5病毒液純化、過濾除菌、分裝。安全性的評價是通過對動物的臨床特征,比如,幼鼠的體重變化,是否瘦弱、弓背、癱瘓、死亡等體征變化,以及幼鼠個體、器官和病理切片觀察等方面進行的。而對其有效性評價則是通過免疫原性和保護力兩個方面進行的。免疫原性是測定小鼠血清的總抗體和中和抗體來反映,保護力是通過被動免疫母鼠對其幼鼠的體重和死亡情況來進行評價。最后,通過對其基因組的測序,堿基和氨基酸序列的分析來進一步確定CVB5減毒活疫苗的分子機制。CVB5溫度敏感株的篩選結(jié)果顯示,(1)從20代開始,CVB5病毒逐漸適應33℃低溫環(huán)境,而對37℃的適應能力降低。說明該病毒在33℃下適應成功;(2)從40代到50代,33℃/37℃的滴度比值大于100倍,則說明從40代開始該病毒已成為溫度敏感型。(3)從接種在Vero細胞、Hela細胞、KMB17細胞中的病變情況可以看出,CVB5最適合生長的細胞基質(zhì)是Vero細胞。通過動物實驗對CVB5溫度敏感株安全性評價的結(jié)果,(1)按三種劑量注射,野毒JZ-WT組在10~6TCID50時體重逐漸下降,而陰性對照與JZ-P50體重變化趨勢持續(xù)上升差異不大。(2)從臨床指標和臟器重量以及器官來看,陰性對照與JZ-P50組明顯比野毒JZ-WT組高。(3)而從組織病理切片中觀察,JZ-P50組織未出現(xiàn)損傷。綜合上述結(jié)果,初步認為CVB5毒株是減毒的。有效性評價結(jié)果顯示,(1)三次免疫小鼠的血清總抗體效價為1:500,中和抗體效價為1:10,單次免疫的小鼠血清總抗體效價為1:50,中和抗體未檢測出來。(2)被動免疫母鼠檢測保護力,發(fā)現(xiàn)免疫減毒株組母鼠出生的幼鼠被野毒株攻毒后全部存活,而免疫PBS組母鼠出生后的幼鼠被野毒株攻毒后到11天全部死亡。這證明該減毒株對小鼠具有很好的保護效力。冷適應傳代株的基因組測序表明,堿基和氨基酸的許多位點突變都涉及了CVB5毒株的溫度敏感性和減毒,這些突變位點包括堿基的C106T、T664C、A754T、T800C、A1322G、G1514T、T1515G、G1517A、T1519C、C2821A、A2827T、T2870C、G3133A、G3543A、A3574G、A3672G、T4476A、G6592A,氨基酸的Q4L、Q257H、W258G、I259T、T693N、E695V、G797D、E934K、K944R、M977V、S1245T、G1950E。本實驗初步對CVB5冷適應減毒活疫苗進行研究,并進一步的證實CVB5毒株是冷適應株、溫度敏感株且具有安全性和有效性,為后期疫苗的中試及大規(guī)模培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳貴元;魏云林;;冷適應微生物的研究現(xiàn)狀與應用前景[J];大理學院學報;2008年04期

2 李永宏，周振榮，，張立明，楊志奎，許亞寧，傅根銘，賈琳;冬初三種加速冷適應方法的效果觀察[J];解放軍預防醫(yī)學雜志;1996年04期

3 王楓;關(guān)于冷適應研究的反思[J];醫(yī)學與哲學;1995年06期

4 楊義軍;姜在福;;加速冷適應的方法及其機理的探討[J];沈陽部隊醫(yī)藥;1995年02期

5 心怡;;晨練“冷適應”后別吃燙食[J];老同志之友;2013年03期

6 林士杰;姜靜;王玉成;;檉柳冷適應蛋白基因(英文)[J];分子植物育種;2006年02期

7 陳玲;胡建新;黃強輝;黃曉;程曉曙;;冷適應減輕寒冷暴露大鼠心肌損傷[J];基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床;2011年10期

8 辛明秀,周培瑾;冷適應微生物產(chǎn)生的冷活性酶[J];微生物學報;2000年06期

9 徐揚,楊澤田,蘇成芝;冷適應大鼠腦組織和脾淋巴細胞蛋白質(zhì)合成活性增強[J];科學通報;1990年19期

10 張皎娥,陳庭才,張作昌,姜在福,劉恩波;南北方戰(zhàn)士冷適應水平調(diào)查[J];解放軍預防醫(yī)學雜志;1990年Z1期

相關(guān)會議論文 前6條

1 楊發(fā)青;錢令嘉;王萬銀;任會榮;胥達;;寒冷適應相關(guān)基因的研究[A];中國生理學會第六屆應用生理學委員會全國學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2003年

2 黃春梅;王政昆;;中緬樹

本文編號：2598875