發(fā)布時(shí)間：2020-03-24 21:22

【摘要】：柯薩奇病毒B組5型(Coxsakievirus B5,CVB5)是引起5歲以下嬰幼兒發(fā)病的一種腸道病毒,輕則能夠造成嬰幼兒的手足口病、腹瀉,重則可引起無菌性腦膜炎、心肌炎、I型糖尿病等并發(fā)癥,對(duì)全球范圍的嬰幼兒的健康造成了不可估量的威脅。然而,目前并未有有效的治療手段,更沒有疫苗來預(yù)防CVB5的感染,因此,CVB5疫苗的研發(fā)刻不容緩。本研究的目的是通過冷適應(yīng)減毒的方法制備CVB5減毒疫苗,通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其安全性和有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)。為了獲得CVB5溫度敏感株,我們通過冷適應(yīng)減毒的方法進(jìn)行,方法如下:將本實(shí)驗(yàn)室凍存的CVB5病毒液過濾除菌后接種于Vero細(xì)胞中,37℃培養(yǎng)1代,即為野毒株,命名JZ-WT;33℃?zhèn)髦?0代,即為溫度敏感株,命名JZ-P50。其中,每10代分別測(cè)定33℃和37℃病毒滴度,通過其不同代次不同溫度之間的滴度比較來判定是否為溫度敏感株。JZ-P50溫度敏感株通過制備疫苗來評(píng)價(jià)其安全性和有效性,方法為將CVB5病毒液純化、過濾除菌、分裝。安全性的評(píng)價(jià)是通過對(duì)動(dòng)物的臨床特征,比如,幼鼠的體重變化,是否瘦弱、弓背、癱瘓、死亡等體征變化,以及幼鼠個(gè)體、器官和病理切片觀察等方面進(jìn)行的。而對(duì)其有效性評(píng)價(jià)則是通過免疫原性和保護(hù)力兩個(gè)方面進(jìn)行的。免疫原性是測(cè)定小鼠血清的總抗體和中和抗體來反映,保護(hù)力是通過被動(dòng)免疫母鼠對(duì)其幼鼠的體重和死亡情況來進(jìn)行評(píng)價(jià)。最后,通過對(duì)其基因組的測(cè)序,堿基和氨基酸序列的分析來進(jìn)一步確定CVB5減毒活疫苗的分子機(jī)制。CVB5溫度敏感株的篩選結(jié)果顯示,(1)從20代開始,CVB5病毒逐漸適應(yīng)33℃低溫環(huán)境,而對(duì)37℃的適應(yīng)能力降低。說明該病毒在33℃下適應(yīng)成功;(2)從40代到50代,33℃/37℃的滴度比值大于100倍,則說明從40代開始該病毒已成為溫度敏感型。(3)從接種在Vero細(xì)胞、Hela細(xì)胞、KMB17細(xì)胞中的病變情況可以看出,CVB5最適合生長(zhǎng)的細(xì)胞基質(zhì)是Vero細(xì)胞。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)CVB5溫度敏感株安全性評(píng)價(jià)的結(jié)果,(1)按三種劑量注射,野毒JZ-WT組在10~6TCID50時(shí)體重逐漸下降,而陰性對(duì)照與JZ-P50體重變化趨勢(shì)持續(xù)上升差異不大。(2)從臨床指標(biāo)和臟器重量以及器官來看,陰性對(duì)照與JZ-P50組明顯比野毒JZ-WT組高。(3)而從組織病理切片中觀察,JZ-P50組織未出現(xiàn)損傷。綜合上述結(jié)果,初步認(rèn)為CVB5毒株是減毒的。有效性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,(1)三次免疫小鼠的血清總抗體效價(jià)為1:500,中和抗體效價(jià)為1:10,單次免疫的小鼠血清總抗體效價(jià)為1:50,中和抗體未檢測(cè)出來。(2)被動(dòng)免疫母鼠檢測(cè)保護(hù)力,發(fā)現(xiàn)免疫減毒株組母鼠出生的幼鼠被野毒株攻毒后全部存活,而免疫PBS組母鼠出生后的幼鼠被野毒株攻毒后到11天全部死亡。這證明該減毒株對(duì)小鼠具有很好的保護(hù)效力。冷適應(yīng)傳代株的基因組測(cè)序表明,堿基和氨基酸的許多位點(diǎn)突變都涉及了CVB5毒株的溫度敏感性和減毒,這些突變位點(diǎn)包括堿基的C106T、T664C、A754T、T800C、A1322G、G1514T、T1515G、G1517A、T1519C、C2821A、A2827T、T2870C、G3133A、G3543A、A3574G、A3672G、T4476A、G6592A,氨基酸的Q4L、Q257H、W258G、I259T、T693N、E695V、G797D、E934K、K944R、M977V、S1245T、G1950E。本實(shí)驗(yàn)初步對(duì)CVB5冷適應(yīng)減毒活疫苗進(jìn)行研究,并進(jìn)一步的證實(shí)CVB5毒株是冷適應(yīng)株、溫度敏感株且具有安全性和有效性,為后期疫苗的中試及大規(guī)模培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2598875