【摘要】：目的:闡明蛻膜巨噬細胞表面Tim-3在孕期弓形蟲感染致不良妊娠結局中的作用機制。方法:體外實驗:取人早孕期流產(chǎn)蛻膜組織標本,分離蛻膜組織,制備單細胞懸液,磁珠分選純化獲得人蛻膜巨噬細胞,將其平均分為正常組、感染組和Tim-3抗體中和感染組,其中,感染組和Tim-3抗體中和感染組加入剛地弓形蟲RH株速殖子(細胞數(shù):蟲子數(shù)=1:2)感染24h。流式細胞術檢測各組蛻膜巨噬細胞表面Tim-3的表達水平、M1型功能分子(膜功能分子CD80、CD86,胞內TNF-α)、M2型功能分子(膜功能分子CD163、CD209、CD206,胞內IL-10)的表達水平。Western Blot技術檢測各組蛻膜巨噬細胞中精氨酸代謝酶iNOS和Arg-I的合成水平。ELISA方法檢測各組人蛻膜巨噬細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-10的水平。體內實驗:建立弓形蟲感染致不良妊娠結局的C57BL/6野生型和Tim-3基因敲除(Tim-3-/-)的孕鼠模型,以未感染組孕鼠作為正常對照組,分為正常組、感染組和Tim-3-/-感染組,感染組和Tim-3-/-感染組分別于孕8天腹腔感染剛地弓形蟲RH株速殖子400條。于孕14天觀察并記錄各組孕鼠妊娠結局,包括孕鼠精神狀態(tài),活胎數(shù)、死胎數(shù)吸和收胎數(shù),胎鼠及胎盤重量,及其出血情況。將剝離的胎盤與子宮制備單細胞懸液,流式細胞術分別檢測各組蛻膜巨噬細胞表面Tim-3、M1型功能分子(膜功能分子CD80、CD86,精氨酸代謝酶iNOS,胞內TNF-α)、M2型功能分子(膜功能分子CD206,精氨酸代謝酶Arg-I,胞內IL-10)的表達水平。結果:體外實驗:流式檢測結果顯示,感染組人蛻膜巨噬細胞表面Tim-3表達水平較正常組明顯降低。流式結果顯示,感染組人蛻膜巨噬細胞表面M1型膜功能分子CD80、CD86表達水平較正常組明顯升高,而M2型膜功能分子CD163,CD209,CD206的表達水平明顯降低(P0.05)。Western Blot結果顯示,感染組人蛻膜巨噬細胞內M1型精氨酸代謝酶iNOS表達明顯升高,而M2型精氨酸代謝酶Arg-I表達明顯降低(p0.05)。流式和ELISA檢測結果顯示,感染組人蛻膜巨噬細胞胞內及培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-10的水平較正常組均升高,但TNF-α升高更為明顯,二者比值TNF-α/IL-10較正常組明顯升高(P＜0.05)。為驗證蛻膜巨噬細胞表面Tim-3對以上功能分子的影響,在Tim-3抗體中和感染組中對以上功能分子進行進一步檢測。流式檢測結果顯示,與感染組相比,Tim-3抗體中和感染組M1型膜功能分子CD80、CD86表達水平明顯升高,而M2型膜功能分子CD163、CD209、CD206表達水平明顯降低(p＜ 0.05),Tim-3仍能檢測到少量表達。Western Blot結果顯示,人蛻膜巨噬細胞內M1型精氨酸代謝酶iNOS表達明顯升高,而M2型精氨酸代謝酶Arg-I表達明顯降低(p0.05)。流式檢測結果顯示,蛻膜巨噬細胞胞內TNF-α、IL-10的表達水平均降低,IL-10降低更為明顯,二者比值TNF-α/IL-10較感染組明顯升高(p＜ 0.05)。ELISA檢測結果顯示,蛻膜巨噬細胞胞培養(yǎng)上清中TNF-α IL-10的分泌水平均升高,TNF-α升高更為明顯,二者比值TNF-α/IL-10明顯升高(p0.05)。體內實驗:與正常組比,感染組弓形蟲感染后出現(xiàn)明顯不良妊娠結局,孕鼠出現(xiàn)萎靡不振,弓背,活動減少,胎鼠中活胎數(shù)明顯減少,胎鼠體積減小,重量減輕,有明顯的吸收胎和死胎,胎盤體積減小及其重量減輕,且胎盤四周有明顯出血。而Tim-3-/-感染組較感染組呈現(xiàn)更為嚴重的不良妊娠結局,孕鼠精神狀態(tài)更加萎靡,弓背、聳毛更加嚴重,胎鼠中出現(xiàn)更多的吸收胎和死胎,有的胎鼠甚至不成形,胎盤體積進一步減小,重量進一步減輕,出血更為嚴重。流式結果顯示,與正常組相比,感染組孕鼠蛻膜巨噬細胞表面Tim-3表達水平明顯降低,蛻膜巨噬細胞表面M1型膜功能分子CD80、CD86表達水平明顯升高,M2型膜功能分子CD206的表達明顯降低(p＜ 0.05):蛻膜巨噬細胞內iNOS的表達水平較正常組明顯升高,而Arg-I則明顯降低,且Tim-3的表達水平與iNOS呈明顯負相關,與Arg-I呈明顯正相關(p＜ 0.05);蛻膜巨噬細胞胞內TNF-α的水平明顯升高,而IL-10的分泌則有所降低(p＜0.05),二者比值TNF-α/IL-10明顯升高(p0.05)。為進一步探索弓形蟲感染所致以上功能分子的改變是否由Tim-3表達水平降低所引起,將Tim-3-/-感染組與感染組進行比較,結果顯示,M1型膜功能分子CD80、CD86較感染組明顯升高,M2型膜功能分子CD206明顯降低(p0.05);蛻膜巨噬細胞內合成iNOS水平較感染組明顯升高,而Arg-I的水平則明顯降低(p0.05);蛻膜巨噬細胞胞內TNF-α的分泌水平較感染組明顯升高,IL-10的分泌也有所升高,但二者比值TNF-α/IL-10較感染組明顯升高(p0.05)。結論:孕期弓形蟲感染導致人和小鼠蛻膜巨噬細胞表面Tim-3表達水平明顯下降,Tim-3表達水平下降進而可引起蛻膜巨噬細胞由M2型向M1型極化,M1型蛻膜巨噬細胞相關功能分子表達增加,對胚胎的殺傷功能增強;M2型蛻膜巨噬細胞相關功能分子表達均明顯減少,母胎耐受功能減弱,這可能是孕期弓形蟲感染致不良妊娠結局發(fā)生的重要分子免疫機制。本研究初步闡明了蛻膜巨噬細胞表面抑制性分子Tim-3在孕期弓形蟲感染致不良妊娠結局中的作用機制,本研究結果為全面闡明孕期弓形蟲感染致不良妊娠結局的分子機制研究增添了新的內容,也必將為尋找并建立有效預防和治療先天性弓形蟲的手段和方法奠定理論基礎,對從根本上降低出生缺陷、提高出生人口質量產(chǎn)生極其重要的意義。
【圖文】：

圖１．人蛻膜巨噬細胞表面Ｔｉｍ－３在正常組、感染組和Ｔｉｍ－３抗體中和感染組表達。逡逑流式細胞術檢測人蛻膜巨噬細胞表面Ｔｉｍ－３在正常組、感染組和Ｔｉｍ－３抗體中和感染組逡逑的表達水平改變。每組至少�。独肆鳟a(chǎn)標本，數(shù)據(jù)以平均仉士標準差顯示，結果懫用非配逡逑對邋Ｔ邋檢驗分析，Ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ邋：正常組，ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋：感染組邋ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋：邋Ｔｉｍ－３邋抗體中逡逑

采用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法檢測各組人脫膜巨嗤細胞ｉＮＯＳ、Ａｒｇ－Ｉ表達。結果顯示：逡逑弓形蟲感染后，ｉＮＯＳ合成明顯升高，Ａｒｇ－丨合成明顯降低。中和感染以后，ｉＮＯＳ逡逑合成較單純感染組則進一步升高，而Ａｒｇ－Ｉ合成較單純感染組進一步降低（圖３，逡逑＊ｐ＜０．０５）邋0逡逑Ａ邐ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ邐？逡逑ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邐＊邐＾邋0邐＿＊＿逡逑—＾一邋章■■■丨丨丨邐ｉＮ０Ｓ邐＾邐—＾ 邐ａ邋§邋°＇８＇邋ｒｎ邐＊逡逑＾邋０．４－邐ｋ邐邐逡逑一…邐＾邐ＪＬ．邋Ｈ邋＜邋０－６－逡逑邐邐Ｉ邐．邋■邋Ｗ邋，

本文編號：2589626