【摘要】：第一部分心臟干細胞(心臟肌球衍生細胞)的分離、培養(yǎng)和鑒定 研究背景 目前,對于缺血性心臟病的治療大都是基于病因的干預性治療,它們在替代死亡心肌細胞的功能及修復梗死后心肌方面的作用有限。干細胞移植是治療缺血性心臟病的新方法之一,用于缺血性心臟病治療的理想種子細胞最好無免疫原性,具有易收獲、能在體外大量擴增、能在心臟微環(huán)境中很好地成長的特性,并能夠促進受損心臟的修復。近年來,大量具有說服力的證據表明,心臟中存在有干細胞池,如果能夠從受體自身心臟中獲得干細胞,自然不存在免疫原性和不適應心臟微環(huán)境的情況,可能具有很好的治療前景,而心臟肌球細胞(CSp)和心臟肌球衍生細胞(CDCs)就是心臟中存在的、含有心臟干細胞的混合細胞集團,其作為缺血性心臟病治療的選擇值得探討。 目的 本部分通過分離和培養(yǎng)心臟本身的CDCs,觀察其生長以及活性狀態(tài),且通過流式細胞術首次分析健康人和不同程度的缺血性心臟病患者來源的CDCs,及不同培養(yǎng)代數CDCs的細胞表型,旨在說明該類型細胞是一種可靠的干細胞治療種子細胞。 方法 健康人和急性心肌梗死患者的心肌組織活檢標本以及接受心臟移植而取出的受體自身心肌組織,利用組織塊培養(yǎng)法收獲細胞,再通過懸浮培養(yǎng)和(或)貼壁培養(yǎng)方式獲得CSp和CDCS。在體外觀察細胞形態(tài),持續(xù)傳代觀察細胞活性,繪制細胞生長曲線。利用流式細胞術檢測不同來源和不同培養(yǎng)代數的CDCs的表面標志物(?)(?)c-Kit、Sca-1、CD105、CD90、CD104b、CD31、CD34、CD45以及Lin1細胞的表達。 結果 CDCs能夠在體外健康生長,并持續(xù)傳代。流式細胞術分析CDCs中各種標志物陽性細胞數量后發(fā)現(xiàn),CDCs中c-Kit+細胞約占6.0%、Sca-1+細胞約占2.5%、CD105+細胞約占100.0%、CD90+細胞約占31.0%、CD31+細胞約占6.0%、CD34+細胞約占5.8%、CD104b+細胞約占2.2%、CD45+細胞和Lin1+細胞各約占1.0%。相對于健康人組和急性心肌梗死組,在缺血性心臟病需要心臟移植患者的心臟中含有更多的c-Kit+、Sca-1+和CD104b+細胞,其所占百分比分別為7.20±0.41、5.98±0.37、6.38±0.51;2.86±0.44、2.23±±0.40、2.55±±0.43；2.17±0.26和2.24±0.35、2.57±±0.35(P0.05)。不同培養(yǎng)代數CDCs間細胞成分差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論 ①通過簡單易行的方法能夠從心肌組織中收獲大量的CSp和CDCs。②不同人群、不同嚴重程度患者來源以及不同培養(yǎng)代數的CDCs具有相似的生長狀態(tài)和細胞成分,該細胞對于所有需要細胞治療的缺血性心臟病患者都是可以選擇的。 ③CSp和CDCs是不含造血干細胞、心肌細胞的,存在于心臟本身的、含有心臟干細胞和支持細胞的、無免疫原性的、能夠更加適應心臟微環(huán)境的混合細胞集團,是理想的種子細胞之一。 第二部分心臟干細胞遷徙出血管的新機制：血管主動外推 研究背景 干細胞治療是心血管疾病治療領域中一個很有希望的手段,但是許多因素限制了其應用,如種子細胞的類型、細胞劑量的優(yōu)化以及移植途徑的選擇等。選擇移植途徑就是選擇細胞與受體心臟間的橋梁,好的移植途徑對患者的創(chuàng)傷應盡可能小,但是目前創(chuàng)傷最小的經靜脈途徑移植,因大多數細胞被肺過濾掉及心臟內短期滯留率不到1%而極少應用。經過冠狀動脈途徑移植被認為是非常理想的途徑,它通過標準球囊導管將細胞移植入再通的梗死冠脈中,移植細胞可以注入到氧和營養(yǎng)物質供應豐富的受損部位,不額外加重心肌的缺血損傷和增加心律失常的發(fā)生,也不增加細胞移植后支架內和罪犯血管再狹窄的可能性,目前許多臨床試驗就采用該方法作為細胞移植途徑。但是,不得不承認的是通過冠狀動脈移植的干細胞大多數還是通過心臟靜脈系統(tǒng)進入到體循環(huán),分布到其它器官,而在心臟內的存留率很低,24h時僅10%左右,因此,如要充分利用這種移植途徑就必須提高移植細胞的滯留率或者提高僅存的10%細胞的作用,而要達到這個目的就必須了解干細胞發(fā)生作用的過程,即干細胞通過罪犯血管移植到達梗死或缺血部位,然后再進入到周圍組織中開始修復活動的過程。到達血管周圍組織的細胞才是真正能夠發(fā)揮作用的細胞,而要到達周圍組織必然經過干細胞遷徙出血管這個步驟。 目的 本研究通過結扎大鼠主動脈,向左心室腔內注射CDCs、CSp和無生物活性的熒光高分子球(PSPs)的方式模擬經冠狀動脈移植細胞。不同時間點處死大鼠,IHC法觀察干細胞出血管的過程,然后用整合素拮抗劑和基質金屬蛋白酶(MMPs)及其同型異構體干預,觀察其在體內和體外模型中對干細胞出血管的影響,旨在為增加干細胞的滯留率或者使數量有限的干細胞更加容易穿透血管發(fā)揮作用提供理論依據。 方法 將CDCs和CSp用FITC-超順磁微球或DiO標記。結扎大鼠主動脈,將CDCs、CSp和PSPs注入左心室腔,不同時間點取出心臟,行冰凍切片,處死前用缺氧探針尾靜脈注射。vWF抗體和DAPI染色血管和細胞核,分析CDCs、CSp或PSPs與血管腔和血管壁的關系,確認干細胞出血管的過程。再分別用整合素拮抗劑和MMPs阻滯劑腹腔注射。在體外利用血管內皮細胞和干細胞構建的體外出血管模型中,同樣用上述藥物干預,在不同時間點用IHC法、Masson染色、超聲心動圖和ELISA法等觀察藥物對干細胞出血管過程的影響。 結果 1.經冠狀動脈移植后,CDCs、CSp或PSPs(?)很快進入微血管,占據了整個管腔,模型制造成功。24h時,CDCs和CSp雖仍在血管腔內,但綠色細胞被邊緣的紅色血管內皮細胞突觸包圍,此時大多數血管已經再通。72h時,移植的CDCs和CSp已經被排至血管外層區(qū)域,并且所有的血管都已完全通暢。而上述時間點中PSPs阻塞了毛細血管,因其無法穿透血管壁屏障,管腔完全閉塞,與前兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。我們明確了干細胞出血管的過程,證實該過程在72h內結束,這不同于以往報道的任何出血管的機制,因此命名為“血管主動外推”機制。另外無生物活性的物質不能被排出血管。 2.當CSp放在單層貼壁生長的靜脈內皮細胞上時,可以發(fā)現(xiàn)內皮細胞形成“口袋”,而CSp落入其中,體外構建出類似的“細胞出血管”模型；分別于共培養(yǎng)后0、2、4和6h時連續(xù)觀察CSp與血管內皮細胞的關系,發(fā)現(xiàn)體外模型中6h后內皮細胞“口袋”包圍CSp。 3.關于整聯(lián)蛋白對干細胞出血管影響的體內實驗結果顯示,腹腔注射整合素拮抗劑RGDS和其假拮抗劑GRGDTP,24h時處死大鼠發(fā)現(xiàn)注射RGDS組較注射G RGDTP組大鼠心臟中CSp的急性滯留數量少(P0.05),內皮細胞“口袋”的形成少(P0.05),遷移出血管的比率也小(P0.05),組織缺氧程度明顯加重(P0.05)。 4.關于整聯(lián)蛋白對干細胞出血管影響的體外實驗結果顯示,使用了RGDS者“口袋”形成明顯減少(P0.001),與PSPs組類似。該過程中RGDS無論預先處理血管內皮細胞還是CSp,均將影響“口袋”的形成。 5.關于MMPs對干細胞出血管影響的體內實驗結果顯示。移植CSp或PSPs24h后,在有CSp的血管壁內可以觀察到MMP2的表達。術后0h、24h和72h定量分析MMP2熒光,發(fā)現(xiàn)移植CSp與移植PSPs相比,血管壁能夠產生較多的MMP2(P0.01)。移植CSp后連續(xù)3d注射廣譜MMPs(?)印制劑GM6001和假抑制劑GM6001-NC,24h和72h發(fā)現(xiàn)應用GM6001組CSp向血管腔外遷移比例明顯減少(P0.01),24h時心臟中內皮細胞“口袋”的形成基本沒有變化(P=0.77)。 6.關于MMPs對干細胞出血管影響的體外實驗結果顯示,將基質膠平鋪于共聚焦專用培養(yǎng)皿中模擬體內環(huán)境,將血管內皮細胞平鋪上面,形成網狀結構,再把CSp放入其中,結果許多遠離內皮細胞網絡的沒有被包圍起來,但是有些恰巧落在內皮細胞網狀結構上的CSp,很快被血管內皮細胞突觸包繞。用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)動態(tài)觀察被裝進“口袋”中的CSp的活動,發(fā)現(xiàn)CSp能夠長入下層的基質膠中。將MMPs阻滯劑GM6001和假阻滯劑GM6001-NC加入上述系統(tǒng)內,48h后,使用了GM6001組長入基質膠中CSp的數量比明顯減少(P0.05)；血管內皮“口袋”比例差異無統(tǒng)計學意義(P=0.69)。另外試驗中我們發(fā)現(xiàn)MMPs阻滯劑只有與CSp接觸才能較大程度上影響細胞的出血管效率。 7.血管主動外推機制對心臟的影響。按照左心室腔內注射物質不同,分為PBS組、CSp組和PSPs組。3周后經Masson染色,PSPs組梗死面積明顯大于其它兩組(P0.01)；24h和72h PBS組、CSp組和PSPs組LVEF基線值相似,3周后PSPs組LVEF明顯下降(P0.05)。并且術后24h和3周時,PSPs組血清中的肌鈣蛋白Ⅰ明顯升高(P0.01)。這說明血管主動外推機制明顯減少心肌細胞死亡。 結論 1.本研究首次提出的血管主動外推機制主要有三步：血管內細胞黏附相互識別、形成血管內皮細胞變形,形成“口袋”包裹干細胞和血管壁外層破潰,這個過程中血管是主動的。 2.血管內皮細胞和干細胞通過整合素“交流”而相互作用,形成“口袋”。 3. MMPs調節(jié)微血管壁破潰,將細胞最終排出血管腔。 4.血管主動外推機制可能是較大干細胞或干細胞集團排出血管的關鍵機制,適時進行干預應該能夠提高干細胞的移植效率,增強干細胞的治療功能。 第三部分心臟干細胞治療急性心肌梗死小鼠中細胞數量與功能效益的研究 研究背景 急性心肌梗死當前的治療方法主要是延緩疾病進展。心肌梗死后瘢痕形成,心肌的損傷將不可逆轉。干細胞治療在改善梗死后心肌負性重塑和心肌再生方面具有很好的效果,但是細胞的應用劑量一直以來都是模糊的,而沒有細胞數量優(yōu)化的臨床研究得到的結論是不完善的,動物實驗研究結果對臨床研究的指導意義也應有待商榷,因此,細胞劑量的研究成為了重要課題。 當然,不同種類干細胞的應用數量也可能有所不同。本課題研究的細胞是CSp。 CSp和CDCs是心臟中固有的、含有心臟干細胞和支持細胞的混合細胞集團。有實驗直接對比了CDCs、骨髓間充質干細胞、脂肪源性間充質干細胞和骨髓源性單核細胞,結果證實在心肌梗死的治療中CDCs可能具有更大的優(yōu)勢。最近結束的關于CDCs的Ⅰ期臨床試驗結果再次證實了它的安全性和優(yōu)良的再生能力,而且還有實驗表明CSp比CDCs具有更強的干細胞性,能夠更好地保持干細胞活性,分泌更多的有益因子,對梗死后心功能的改善作用更強。另外,CSp在NOGA心內膜心肌電機械標測系統(tǒng)指引下心內膜注射的臨床研究正在申請中,因此,對CSp使用劑量的研究就別具意義。 目的 本部分探討CSp直接心肌注射治療心肌梗死中細胞劑量和效益的依賴關系,并通過組織學分析,尋找產生與劑量相關效果的機制,旨在為大動物和人體試驗提供可靠數據。 方法 培養(yǎng)患者心肌組織來源的CSp,用SCID-beige小鼠制備心肌梗死模型,在梗死區(qū)域分四個點注射PBS和由1×104、5×104、1×105和5×105CDCs形成的CSp細胞懸液。采用二維超聲心動圖檢測LVEF, Masson染色分析心室結構,組織免疫熒光染色心臟冰凍切片觀察新生血管平滑肌、分裂心肌細胞和凋亡細胞數量,Western blot法檢測VEGF和SDF-la表達,分析不同劑量細胞移植后梗死心臟產生的不同變化。 結果 1.不同劑量細胞在心臟中24h滯留率。按照注射PBS和由1×104、5×104、1×105和5×105CDCs形成的CSp將小鼠分為五組。術后24h細胞在第二、三、四和五組心臟中的滯留率相似,分別為(%)(11.42±2.24)%、(9.97±4.24)%、(11.70±4.73)%、(10.23±3.95)%(P0.05)。 2.不同劑量細胞對心臟功能的作用結果。LVEF基線值相似,分別為31.48±1.87、29.56±2.14、30.53±2.38、30.92±4.34、32.87±1.98(P0.05),術后3周后LVEF值分別為21.92±2.65、27.08±3.54、41.79±6.18、47.18±8.73、47.26±8.85(P＜0.05)。 3.不同劑量細胞對心肌重塑的作用結果。Masson染色后分析術后3周的心臟冰凍切片,梗死壁厚度(mm)分別為0.17±0.06、0.34±0.09、0.93±0.35、0.97±0.35、1.06±0.32(P0.05)；梗死區(qū)內活組織面積比分別為13.25±1.52、16.18±2.91、28.0±2.20、28.78±3.54、32.08±3.22(P0.05)。 4.不同劑量細胞再生作用的結果。梗死區(qū)內的α-SMA+細胞數分別為2.6±1.52、3.4±1.14、11.6±3.91、12.8±4.76、14.4±5.81(P0.05)；Ki-67+/α-SA+細胞數分別為1.00±0.82、2.14±1.35、5.00±1.15、5.86±1.77、6.71±1.11(P0.05)；TUNEL+細胞數分別為6.83±1.47、5.0±1.79、1.83±0.75、1.5±0.55、1.5±1.05(P0.05)。所有的結果都顯示出第二組較第一組有改善趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；第三、四和五組間隨細胞數量增加改善作用亦有上升趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；第三、四和五組均較第一和二組有明顯改善趨勢,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5.檢測心臟組織中的VEGF和SDF-1α表達。結果顯示細胞劑量較高的第三、四和五組含量明顯多于低劑量的第一組和對照組(P0.05),第三、四和五組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),對照組和第一組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),相對表達量灰度值比(與GAPDH相比)分別為VEGF:0.11±0.02、0.12±0.02、0.33±0.03、0.34±0.02、0.34±0.03(P0.05)：SDF-1:0.04±0.01、0.05±0.02、0.16±0.02、0.16±0.03、0.17±0.02(P0.05)。 結論 隨著移植細胞數量的增加,對梗死后心臟的改善作用增強,但高于5×104移植細胞數量后,細胞數量的增加對心臟內再生、分裂心肌細胞及凋亡心肌細胞數量、梗死壁厚度及存活心肌數量和心功能的改善作用變化不大。因此我們推測在一定范圍內細胞數量與所產生的作用成正比,達到平臺期的那個劑量是最佳劑量。就本實驗結果而言,小鼠心肌梗死模型中5×104是最佳劑量,該數量細胞指導下的人體試驗細胞數量為1.50×108。 第四部分直接心肌內注射血小板纖維蛋白支架促進內源性修復和改善心梗后心臟功能的研究 研究背景 在所有非傳染性致死疾病中,心血管疾病占了首位,其中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病又是心血管疾病中最常見的一種。心肌梗死的最終結局極有可能是心功能衰竭,而其中大量心肌細胞的損失在心功能衰竭進展中起著重要作用。目前常規(guī)的治療手段以緩解癥狀為主,治療效果有限。心臟移植雖能代替受損心臟,但供體難以獲取,臨床難以廣泛應用,因此尋找新的方法從結構和功能上替代死亡的心肌組織刻不容緩。新近組織工程和生物材料的發(fā)展為缺血性心臟病的治療或細胞血管成形術提供了很好的選擇�？勺⑸溆蒙锊牧峡梢酝ㄟ^微創(chuàng)的方式達到目標位置,可以作為治療的載體或獨自成為一種治療手段。多種可注射用生物材料如纖維蛋白膠、膠原、藻酸鹽、基質膠、自組織肽、細胞外基質乳液、合成高分子水凝膠和微球等已經用于心肌再生治療,且有了一定的效果。一種理想的用于缺血性心臟病治療的生物材料應該具有以下特點：取材、制備簡單;可注射,對患者的創(chuàng)傷很��；可降解,能夠適時為心臟修復提供支持；良好的生物兼容性,最好是來自于受體本身,這樣可不引起或引起很小的排異反應；能夠為受損心臟提供結構和功能上的支持。血小板纖維蛋白支架具有上述特性,且未見在缺血性心臟中應用的報道。 目的 本課題制備大鼠心肌梗死模型,將血小板纖維蛋白支架直接注射到梗死區(qū)域周圍,通過IHC法、ELISA法、超聲心動圖、Masson染色等多種方法觀察血小板纖維蛋白支架在促進梗死后心肌修復和改善心臟功能中的作用,探討血小板纖維蛋白支架在心肌梗死治療中的治療潛能,為缺血性心臟病的治療提供一個新方法。 方法 體外實驗：從同品系大鼠腹主靜脈抽血并提取含有血小板的血漿,與溫熱的DMEM等體積混勻制膠。觀察血小板纖維蛋白支架的結構形態(tài)特征；與新生大鼠心肌細胞混合培養(yǎng),觀察新生大鼠心肌細胞的形態(tài)及活性；用ELISA法檢測不同時間段血小板纖維蛋白支架條件培養(yǎng)基中的細胞因子。體內試驗：利用冠狀動脈結扎法制備大鼠急性心肌梗死模型。分兩組觀察：第一組(DMEM組)在梗死區(qū)直接心肌注射PBS；第二組(血小板纖維蛋白支架組)在梗死區(qū)直接注射血小板纖維蛋白支架。注射部位在梗死區(qū)域周邊。微觀上觀察血小板纖維蛋白支架在心肌內的降解特征,觀察新生心肌細胞、內皮血管、毛細血管密度、募集內源性修復、心肌細胞形態(tài)及炎癥反應等情況；宏觀上觀察大鼠心肌梗死后心功能和大體形態(tài)的變化。 結果 體外實驗結果 1.含血小板血漿與DMEM混合,小于30s凝膠開始形成,120s內完全成膠。HE染色可見血小板纖維蛋白支架成纖維樣結構,內含血小板。 2. ELISA法檢測不同時間段條件培養(yǎng)基中VEGF、IGF-1和HGF的表達,可見血小板纖維蛋白支架可以持續(xù)穩(wěn)定表達活性細胞因子。 3.血小板纖維蛋白支架中大鼠新生心肌細胞形態(tài)和活性與常規(guī)條件培養(yǎng)下差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),這說明血小板纖維蛋白支架無細胞毒性。 體內試驗結果 4.血小板纖維蛋白支架在體內可以降解,第1天、第7天和第14天該膠的面積百分比分別為100.00%、(41.50±7.89)%和(10.47±5.45)%。 5.將血小板纖維蛋白支架和PBS注入梗死大鼠心臟后第7天時,血小板纖維蛋白支架組較PBS組梗死區(qū)域中,心肌細胞數量明顯增加(P0.0001)；內皮細胞數量明顯增加(P0.05)；凋亡細胞數量明顯減少(P0.01)；c-Kit+細胞數量明顯增加(P0.01)；CD68+巨噬細胞數量明顯減少(P0.01),這說明血小板纖維蛋白支架能夠促進心肌再生,募集干細胞進入梗死區(qū)域,且具有抗炎作用。 6.血小板纖維蛋白支架和PBS梗死區(qū)域注射后3周,血小板纖維蛋白支架組較PBS組梗死區(qū)域中,毛細血管密度明顯增加(P0.001)；IHC染色和分離心肌細胞ICC染色均發(fā)現(xiàn)心肌細胞橫截面積面積明顯減小(P0.001和P0.05),這說明血小板纖維蛋白支架能夠促進局部血管的生成,增加血流供應,并且有效地減輕存活心肌的代償性肥大。 7.血小板纖維蛋白支架組和PBS組3周時Masson染色定量形態(tài)學分析發(fā)現(xiàn)血小板纖維蛋白支架組梗死區(qū)域室壁增厚(P0.05)；左心室腔面積減小(P0.05)；梗死區(qū)域周長占左心室周長的百分比降低(P0.05)。兩組大鼠心功能基線值相同(P0.05),但是3周時血小板纖維蛋白支架組心功能明顯優(yōu)于PBS組(P0.05)。這說明血小板纖維蛋白支架能夠逆轉心肌梗死后心臟重塑,改善心臟功能。 結論 心肌內注射自體血小板纖維蛋白支架可以通過增加新生心肌細胞、內皮細胞數量,增加毛細血管密度,啟動募集內源性修復系統(tǒng),減少梗死部位炎癥反應,維持正常的細胞形態(tài),從而改善心肌梗死后心臟功能,是缺血性心臟病治療和治療載體的理想選擇。 第五部分心臟干細胞與血小板纖維蛋白支架聯(lián)合移植在大鼠心肌梗死模型中的心臟再生研究 研究背景 可注射生物材料聯(lián)合干細胞,如骨髓細胞、脂肪源干細胞和骨髓源性誘導心臟干細胞被證實能夠改善心臟功能,而另一些研究則發(fā)現(xiàn)聯(lián)合細胞治療與單用生物材料治療心肌梗死最終的結果相似,究其原因無外乎生物材料和干細胞搭配的合理性。只有好的生物材料聯(lián)合好的干細胞種子,且兩者之間又能相互促進才是好的選擇,也會對心肌梗死后心臟的修復起到更大作用。 近十年來,隨著對心臟干細胞認識的不斷加深,很多研究認為心臟干細胞具有組織再生功能,在體內能夠分化成為多種類型的成熟細胞,如心肌細胞、血管內皮細胞和血管平滑肌細胞等,因此用干細胞治療心肌梗死的研究引起了大家的普遍關注。CDCs是心臟干細胞中的一種,有實驗證明CDCs較骨髓來源的間充質干細胞、脂肪來源的間充質干細胞以及骨髓單核細胞在心臟修復方面具有更大的優(yōu)勢。另外上一章中我們發(fā)現(xiàn)血小板纖維蛋白支架不僅具有良好的治療效果,而且與心臟組織有良好的的兼容性,因此我們推測血小板纖維蛋白支架和CDCs(?)昆合后,血小板纖維蛋白支架可以為CDCs提供良好的3D生長系統(tǒng),這不僅使干細胞具有良好的生長空間和微環(huán)境,而且還能夠延長干細胞在心臟中的存留時間,有更加充裕的時間發(fā)揮作用；兩者相互作用,促進心臟本身產生有利因子和CDCs發(fā)揮再生作用。 目的 本部分首先在體外研究血小板纖維蛋白支架與CDCs間的相互作用,再構建大鼠心肌梗死模型,用血小板纖維蛋白支架聯(lián)合心臟干細胞移植,觀察對大鼠心臟結構和功能的變化,研究預先種植干細胞的生物材料是否具有更強的保護作用并探討其機制。 方法 體外實驗：從同品系大鼠腹主靜脈采血并提取含有血小板的血漿,與溫熱的DMEM等體積混勻制膠。觀察血小板纖維蛋白支架的結構形態(tài)特征：CDCs在血小板纖維蛋白支架中的生長狀況以及血小板纖維蛋白支架的降解。新生大鼠心肌細胞混合在含或不含CDCs的血小板纖維蛋白支架中培養(yǎng),觀察新生大鼠心肌細胞的形態(tài)及活性；采集不同時段血小板纖維蛋白支架的條件培養(yǎng)基用ELISA法檢測細胞因子。體內試驗：利用冠狀動脈結扎法制備大鼠急性心肌梗死模型,分三3組：第1組(DMEM組)在梗死區(qū)直接心肌注射PBS；第二組(血小板纖維蛋白支架組,Gel組)在梗死區(qū)直接心肌注射血小板纖維蛋白支架；第三第3組(血小板纖維蛋白支架+CDCs組,Gel+CDCs組)。注射部位均在梗死區(qū)域周邊。微觀上觀察新生心肌細胞、內皮血管、毛細血管密度、募集內源性修復、肌細胞體積及炎癥反應情況；宏觀上觀察大鼠心肌梗死后心臟結構和功能。 結果 體外實驗結果 1.用ELISA法分析含和不含CDCs的血小板纖維蛋白支架的第2、5、9和14天的條件培養(yǎng)基中VEGF、IGF-1和SDF-1的含量,各時間點混合了CDCs的血小板纖維蛋白支架能夠分泌更多的細胞因子(P0.05) 2.觀察在血小板纖維蛋白支架中和常規(guī)條件下培養(yǎng)的CDCs擴增數量(相對于12h的細胞數),結果發(fā)現(xiàn)12h時、第3天、第7天和第14天的細胞數量比較,兩組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),提示血小板纖維蛋白支架不影響CDCs細胞擴增。第14天在血小板纖維蛋白支架中和在常規(guī)條件下生長的CDCs長短軸之比,前者明顯大于后者(P0.05)；再用LIVE/DEAD細胞活性／毒性試劑盒染色在血小板纖維蛋白支架中和在常規(guī)條件下的CDCs死亡細胞百分比,前者明顯小于后者(P0.05),這些說明血小板纖維蛋白支架不僅能促進細胞生長,而且很好地保持了細胞活性。 3.為了評價體外血小板纖維蛋白支架的降解,我們在12h、第3天、第7天和第14天時測量血小板纖維蛋白支架中CDCs分布的"Z-distance"(評價血小板纖維蛋白支架的降解),結果發(fā)現(xiàn)14天后有將近2/3的支架降解。 4.用IHC法觀察培養(yǎng)第14天血小板纖維蛋白支架中CDCs,結果發(fā)現(xiàn)CDCs能夠分化成表達血管特異性標志物α-SA、vWF和a-SMA的細胞。 5.在含有CDCs的血小板纖維蛋白支架和單純血小板纖維蛋白支架中培養(yǎng)的NRCMs,前者長短軸之比明顯大于后者(P0.05),且跳動MRCMs所占比例也明顯增多(P0.05),這說明血小板纖維蛋白支架聯(lián)合CDCs能夠更好地促進心肌細胞的生長以及保持良好的活性。 體內試驗結果 6.制備大鼠心肌梗死模型,然后進行CDCs或血小板纖維蛋白支架移植。定量分析Gel+CDCs組和Gel組中內皮細胞、心肌細胞和c-Kit+細胞,結果前者明顯多于后者(P0.05),說明含有CDCs的血小板纖維蛋白支架更加有利于心臟的再生。 7.分析Masson染色心臟冰凍切片,結果發(fā)現(xiàn)Gel+CDCs組梗死面積最小,梗死壁厚度最大(P0.05),說明血小板纖維蛋白支架聯(lián)合CDCs移植能夠更好地逆轉心室負性重塑,改善心臟的結構。 8.超聲心動圖檢查3組大鼠術后左室射血分數基線值相同(P0.05),說明造�；疽恢�。3周后,在對照組中LVEF中進行性下降,最大的LVEF值在Gel+CDCs組(P0.05),這說明含有CDCs的血小板纖維蛋白支架從結構上改變了梗死后心室,改善了梗死后心臟功能 9.定量分析CDCs直接再生的作用,Gel+CDCs組中的CM-DiI+心肌細胞僅占28.7%和27.3%,說明血小板纖維蛋白支架聯(lián)合CDCs所起的作用中仍然以旁分泌為主。 結論 1.血小板纖維蛋白支架中有利于CDCs生長,且兩者聯(lián)合促進心肌細胞的生長。 2.梗死后心肌內注射含有CDCs的血小板纖維蛋白支架具有更好的保護作用。 3.血小板纖維蛋白支架聯(lián)合CDCs主要通過增加新生心肌細胞、內皮細胞數量,增加毛細血管密度,啟動募集內源性修復系統(tǒng),從而逆轉或停止心臟負性重塑,改善梗死后心臟功能,是缺血性心臟病治療的理想選擇。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R542.22;R-332

【共引文獻】

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中國博士學位論文全文數據庫 前1條

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本文編號：2586537