【摘要】：第一部分心臟干細(xì)胞(心臟肌球衍生細(xì)胞)的分離、培養(yǎng)和鑒定 研究背景 目前,對(duì)于缺血性心臟病的治療大都是基于病因的干預(yù)性治療,它們?cè)谔娲劳鲂募〖?xì)胞的功能及修復(fù)梗死后心肌方面的作用有限。干細(xì)胞移植是治療缺血性心臟病的新方法之一,用于缺血性心臟病治療的理想種子細(xì)胞最好無(wú)免疫原性,具有易收獲、能在體外大量擴(kuò)增、能在心臟微環(huán)境中很好地成長(zhǎng)的特性,并能夠促進(jìn)受損心臟的修復(fù)。近年來(lái),大量具有說(shuō)服力的證據(jù)表明,心臟中存在有干細(xì)胞池,如果能夠從受體自身心臟中獲得干細(xì)胞,自然不存在免疫原性和不適應(yīng)心臟微環(huán)境的情況,可能具有很好的治療前景,而心臟肌球細(xì)胞(CSp)和心臟肌球衍生細(xì)胞(CDCs)就是心臟中存在的、含有心臟干細(xì)胞的混合細(xì)胞集團(tuán),其作為缺血性心臟病治療的選擇值得探討。 目的 本部分通過(guò)分離和培養(yǎng)心臟本身的CDCs,觀察其生長(zhǎng)以及活性狀態(tài),且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)首次分析健康人和不同程度的缺血性心臟病患者來(lái)源的CDCs,及不同培養(yǎng)代數(shù)CDCs的細(xì)胞表型,旨在說(shuō)明該類型細(xì)胞是一種可靠的干細(xì)胞治療種子細(xì)胞。 方法 健康人和急性心肌梗死患者的心肌組織活檢標(biāo)本以及接受心臟移植而取出的受體自身心肌組織,利用組織塊培養(yǎng)法收獲細(xì)胞,再通過(guò)懸浮培養(yǎng)和(或)貼壁培養(yǎng)方式獲得CSp和CDCS。在體外觀察細(xì)胞形態(tài),持續(xù)傳代觀察細(xì)胞活性,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同來(lái)源和不同培養(yǎng)代數(shù)的CDCs的表面標(biāo)志物(?)(?)c-Kit、Sca-1、CD105、CD90、CD104b、CD31、CD34、CD45以及Lin1細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)果 CDCs能夠在體外健康生長(zhǎng),并持續(xù)傳代。流式細(xì)胞術(shù)分析CDCs中各種標(biāo)志物陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量后發(fā)現(xiàn),CDCs中c-Kit+細(xì)胞約占6.0%、Sca-1+細(xì)胞約占2.5%、CD105+細(xì)胞約占100.0%、CD90+細(xì)胞約占31.0%、CD31+細(xì)胞約占6.0%、CD34+細(xì)胞約占5.8%、CD104b+細(xì)胞約占2.2%、CD45+細(xì)胞和Lin1+細(xì)胞各約占1.0%。相對(duì)于健康人組和急性心肌梗死組,在缺血性心臟病需要心臟移植患者的心臟中含有更多的c-Kit+、Sca-1+和CD104b+細(xì)胞,其所占百分比分別為7.20±0.41、5.98±0.37、6.38±0.51;2.86±0.44、2.23±±0.40、2.55±±0.43；2.17±0.26和2.24±0.35、2.57±±0.35(P0.05)。不同培養(yǎng)代數(shù)CDCs間細(xì)胞成分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 ①通過(guò)簡(jiǎn)單易行的方法能夠從心肌組織中收獲大量的CSp和CDCs。②不同人群、不同嚴(yán)重程度患者來(lái)源以及不同培養(yǎng)代數(shù)的CDCs具有相似的生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞成分,該細(xì)胞對(duì)于所有需要細(xì)胞治療的缺血性心臟病患者都是可以選擇的。 ③CSp和CDCs是不含造血干細(xì)胞、心肌細(xì)胞的,存在于心臟本身的、含有心臟干細(xì)胞和支持細(xì)胞的、無(wú)免疫原性的、能夠更加適應(yīng)心臟微環(huán)境的混合細(xì)胞集團(tuán),是理想的種子細(xì)胞之一。 第二部分心臟干細(xì)胞遷徙出血管的新機(jī)制：血管主動(dòng)外推 研究背景 干細(xì)胞治療是心血管疾病治療領(lǐng)域中一個(gè)很有希望的手段,但是許多因素限制了其應(yīng)用,如種子細(xì)胞的類型、細(xì)胞劑量的優(yōu)化以及移植途徑的選擇等。選擇移植途徑就是選擇細(xì)胞與受體心臟間的橋梁,好的移植途徑對(duì)患者的創(chuàng)傷應(yīng)盡可能小,但是目前創(chuàng)傷最小的經(jīng)靜脈途徑移植,因大多數(shù)細(xì)胞被肺過(guò)濾掉及心臟內(nèi)短期滯留率不到1%而極少應(yīng)用。經(jīng)過(guò)冠狀動(dòng)脈途徑移植被認(rèn)為是非常理想的途徑,它通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)球囊導(dǎo)管將細(xì)胞移植入再通的梗死冠脈中,移植細(xì)胞可以注入到氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)豐富的受損部位,不額外加重心肌的缺血損傷和增加心律失常的發(fā)生,也不增加細(xì)胞移植后支架內(nèi)和罪犯血管再狹窄的可能性,目前許多臨床試驗(yàn)就采用該方法作為細(xì)胞移植途徑。但是,不得不承認(rèn)的是通過(guò)冠狀動(dòng)脈移植的干細(xì)胞大多數(shù)還是通過(guò)心臟靜脈系統(tǒng)進(jìn)入到體循環(huán),分布到其它器官,而在心臟內(nèi)的存留率很低,24h時(shí)僅10%左右,因此,如要充分利用這種移植途徑就必須提高移植細(xì)胞的滯留率或者提高僅存的10%細(xì)胞的作用,而要達(dá)到這個(gè)目的就必須了解干細(xì)胞發(fā)生作用的過(guò)程,即干細(xì)胞通過(guò)罪犯血管移植到達(dá)梗死或缺血部位,然后再進(jìn)入到周圍組織中開始修復(fù)活動(dòng)的過(guò)程。到達(dá)血管周圍組織的細(xì)胞才是真正能夠發(fā)揮作用的細(xì)胞,而要到達(dá)周圍組織必然經(jīng)過(guò)干細(xì)胞遷徙出血管這個(gè)步驟。 目的 本研究通過(guò)結(jié)扎大鼠主動(dòng)脈,向左心室腔內(nèi)注射CDCs、CSp和無(wú)生物活性的熒光高分子球(PSPs)的方式模擬經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植細(xì)胞。不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,IHC法觀察干細(xì)胞出血管的過(guò)程,然后用整合素拮抗劑和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其同型異構(gòu)體干預(yù),觀察其在體內(nèi)和體外模型中對(duì)干細(xì)胞出血管的影響,旨在為增加干細(xì)胞的滯留率或者使數(shù)量有限的干細(xì)胞更加容易穿透血管發(fā)揮作用提供理論依據(jù)。 方法 將CDCs和CSp用FITC-超順磁微球或DiO標(biāo)記。結(jié)扎大鼠主動(dòng)脈,將CDCs、CSp和PSPs注入左心室腔,不同時(shí)間點(diǎn)取出心臟,行冰凍切片,處死前用缺氧探針尾靜脈注射。vWF抗體和DAPI染色血管和細(xì)胞核,分析CDCs、CSp或PSPs與血管腔和血管壁的關(guān)系,確認(rèn)干細(xì)胞出血管的過(guò)程。再分別用整合素拮抗劑和MMPs阻滯劑腹腔注射。在體外利用血管內(nèi)皮細(xì)胞和干細(xì)胞構(gòu)建的體外出血管模型中,同樣用上述藥物干預(yù),在不同時(shí)間點(diǎn)用IHC法、Masson染色、超聲心動(dòng)圖和ELISA法等觀察藥物對(duì)干細(xì)胞出血管過(guò)程的影響。 結(jié)果 1.經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植后,CDCs、CSp或PSPs(?)很快進(jìn)入微血管,占據(jù)了整個(gè)管腔,模型制造成功。24h時(shí),CDCs和CSp雖仍在血管腔內(nèi),但綠色細(xì)胞被邊緣的紅色血管內(nèi)皮細(xì)胞突觸包圍,此時(shí)大多數(shù)血管已經(jīng)再通。72h時(shí),移植的CDCs和CSp已經(jīng)被排至血管外層區(qū)域,并且所有的血管都已完全通暢。而上述時(shí)間點(diǎn)中PSPs阻塞了毛細(xì)血管,因其無(wú)法穿透血管壁屏障,管腔完全閉塞,與前兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。我們明確了干細(xì)胞出血管的過(guò)程,證實(shí)該過(guò)程在72h內(nèi)結(jié)束,這不同于以往報(bào)道的任何出血管的機(jī)制,因此命名為“血管主動(dòng)外推”機(jī)制。另外無(wú)生物活性的物質(zhì)不能被排出血管。 2.當(dāng)CSp放在單層貼壁生長(zhǎng)的靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上時(shí),可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞形成“口袋”,而CSp落入其中,體外構(gòu)建出類似的“細(xì)胞出血管”模型；分別于共培養(yǎng)后0、2、4和6h時(shí)連續(xù)觀察CSp與血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)體外模型中6h后內(nèi)皮細(xì)胞“口袋”包圍CSp。 3.關(guān)于整聯(lián)蛋白對(duì)干細(xì)胞出血管影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腹腔注射整合素拮抗劑RGDS和其假拮抗劑GRGDTP,24h時(shí)處死大鼠發(fā)現(xiàn)注射RGDS組較注射G RGDTP組大鼠心臟中CSp的急性滯留數(shù)量少(P0.05),內(nèi)皮細(xì)胞“口袋”的形成少(P0.05),遷移出血管的比率也小(P0.05),組織缺氧程度明顯加重(P0.05)。 4.關(guān)于整聯(lián)蛋白對(duì)干細(xì)胞出血管影響的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,使用了RGDS者“口袋”形成明顯減少(P0.001),與PSPs組類似。該過(guò)程中RGDS無(wú)論預(yù)先處理血管內(nèi)皮細(xì)胞還是CSp,均將影響“口袋”的形成。 5.關(guān)于MMPs對(duì)干細(xì)胞出血管影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示。移植CSp或PSPs24h后,在有CSp的血管壁內(nèi)可以觀察到MMP2的表達(dá)。術(shù)后0h、24h和72h定量分析MMP2熒光,發(fā)現(xiàn)移植CSp與移植PSPs相比,血管壁能夠產(chǎn)生較多的MMP2(P0.01)。移植CSp后連續(xù)3d注射廣譜MMPs(?)印制劑GM6001和假抑制劑GM6001-NC,24h和72h發(fā)現(xiàn)應(yīng)用GM6001組CSp向血管腔外遷移比例明顯減少(P0.01),24h時(shí)心臟中內(nèi)皮細(xì)胞“口袋”的形成基本沒(méi)有變化(P=0.77)。 6.關(guān)于MMPs對(duì)干細(xì)胞出血管影響的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,將基質(zhì)膠平鋪于共聚焦專用培養(yǎng)皿中模擬體內(nèi)環(huán)境,將血管內(nèi)皮細(xì)胞平鋪上面,形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),再把CSp放入其中,結(jié)果許多遠(yuǎn)離內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的沒(méi)有被包圍起來(lái),但是有些恰巧落在內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的CSp,很快被血管內(nèi)皮細(xì)胞突觸包繞。用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察被裝進(jìn)“口袋”中的CSp的活動(dòng),發(fā)現(xiàn)CSp能夠長(zhǎng)入下層的基質(zhì)膠中。將MMPs阻滯劑GM6001和假阻滯劑GM6001-NC加入上述系統(tǒng)內(nèi),48h后,使用了GM6001組長(zhǎng)入基質(zhì)膠中CSp的數(shù)量比明顯減少(P0.05)；血管內(nèi)皮“口袋”比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.69)。另外試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)MMPs阻滯劑只有與CSp接觸才能較大程度上影響細(xì)胞的出血管效率。 7.血管主動(dòng)外推機(jī)制對(duì)心臟的影響。按照左心室腔內(nèi)注射物質(zhì)不同,分為PBS組、CSp組和PSPs組。3周后經(jīng)Masson染色,PSPs組梗死面積明顯大于其它兩組(P0.01)；24h和72h PBS組、CSp組和PSPs組LVEF基線值相似,3周后PSPs組LVEF明顯下降(P0.05)。并且術(shù)后24h和3周時(shí),PSPs組血清中的肌鈣蛋白Ⅰ明顯升高(P0.01)。這說(shuō)明血管主動(dòng)外推機(jī)制明顯減少心肌細(xì)胞死亡。 結(jié)論 1.本研究首次提出的血管主動(dòng)外推機(jī)制主要有三步：血管內(nèi)細(xì)胞黏附相互識(shí)別、形成血管內(nèi)皮細(xì)胞變形,形成“口袋”包裹干細(xì)胞和血管壁外層破潰,這個(gè)過(guò)程中血管是主動(dòng)的。 2.血管內(nèi)皮細(xì)胞和干細(xì)胞通過(guò)整合素“交流”而相互作用,形成“口袋”。 3. MMPs調(diào)節(jié)微血管壁破潰,將細(xì)胞最終排出血管腔。 4.血管主動(dòng)外推機(jī)制可能是較大干細(xì)胞或干細(xì)胞集團(tuán)排出血管的關(guān)鍵機(jī)制,適時(shí)進(jìn)行干預(yù)應(yīng)該能夠提高干細(xì)胞的移植效率,增強(qiáng)干細(xì)胞的治療功能。 第三部分心臟干細(xì)胞治療急性心肌梗死小鼠中細(xì)胞數(shù)量與功能效益的研究 研究背景 急性心肌梗死當(dāng)前的治療方法主要是延緩疾病進(jìn)展。心肌梗死后瘢痕形成,心肌的損傷將不可逆轉(zhuǎn)。干細(xì)胞治療在改善梗死后心肌負(fù)性重塑和心肌再生方面具有很好的效果,但是細(xì)胞的應(yīng)用劑量一直以來(lái)都是模糊的,而沒(méi)有細(xì)胞數(shù)量?jī)?yōu)化的臨床研究得到的結(jié)論是不完善的,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)臨床研究的指導(dǎo)意義也應(yīng)有待商榷,因此,細(xì)胞劑量的研究成為了重要課題。 當(dāng)然,不同種類干細(xì)胞的應(yīng)用數(shù)量也可能有所不同。本課題研究的細(xì)胞是CSp。 CSp和CDCs是心臟中固有的、含有心臟干細(xì)胞和支持細(xì)胞的混合細(xì)胞集團(tuán)。有實(shí)驗(yàn)直接對(duì)比了CDCs、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓源性單核細(xì)胞,結(jié)果證實(shí)在心肌梗死的治療中CDCs可能具有更大的優(yōu)勢(shì)。最近結(jié)束的關(guān)于CDCs的Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果再次證實(shí)了它的安全性和優(yōu)良的再生能力,而且還有實(shí)驗(yàn)表明CSp比CDCs具有更強(qiáng)的干細(xì)胞性,能夠更好地保持干細(xì)胞活性,分泌更多的有益因子,對(duì)梗死后心功能的改善作用更強(qiáng)。另外,CSp在NOGA心內(nèi)膜心肌電機(jī)械標(biāo)測(cè)系統(tǒng)指引下心內(nèi)膜注射的臨床研究正在申請(qǐng)中,因此,對(duì)CSp使用劑量的研究就別具意義。 目的 本部分探討CSp直接心肌注射治療心肌梗死中細(xì)胞劑量和效益的依賴關(guān)系,并通過(guò)組織學(xué)分析,尋找產(chǎn)生與劑量相關(guān)效果的機(jī)制,旨在為大動(dòng)物和人體試驗(yàn)提供可靠數(shù)據(jù)。 方法 培養(yǎng)患者心肌組織來(lái)源的CSp,用SCID-beige小鼠制備心肌梗死模型,在梗死區(qū)域分四個(gè)點(diǎn)注射PBS和由1×104、5×104、1×105和5×105CDCs形成的CSp細(xì)胞懸液。采用二維超聲心動(dòng)圖檢測(cè)LVEF, Masson染色分析心室結(jié)構(gòu),組織免疫熒光染色心臟冰凍切片觀察新生血管平滑肌、分裂心肌細(xì)胞和凋亡細(xì)胞數(shù)量,Western blot法檢測(cè)VEGF和SDF-la表達(dá),分析不同劑量細(xì)胞移植后梗死心臟產(chǎn)生的不同變化。 結(jié)果 1.不同劑量細(xì)胞在心臟中24h滯留率。按照注射PBS和由1×104、5×104、1×105和5×105CDCs形成的CSp將小鼠分為五組。術(shù)后24h細(xì)胞在第二、三、四和五組心臟中的滯留率相似,分別為(%)(11.42±2.24)%、(9.97±4.24)%、(11.70±4.73)%、(10.23±3.95)%(P0.05)。 2.不同劑量細(xì)胞對(duì)心臟功能的作用結(jié)果。LVEF基線值相似,分別為31.48±1.87、29.56±2.14、30.53±2.38、30.92±4.34、32.87±1.98(P0.05),術(shù)后3周后LVEF值分別為21.92±2.65、27.08±3.54、41.79±6.18、47.18±8.73、47.26±8.85(P＜0.05)。 3.不同劑量細(xì)胞對(duì)心肌重塑的作用結(jié)果。Masson染色后分析術(shù)后3周的心臟冰凍切片,梗死壁厚度(mm)分別為0.17±0.06、0.34±0.09、0.93±0.35、0.97±0.35、1.06±0.32(P0.05)；梗死區(qū)內(nèi)活組織面積比分別為13.25±1.52、16.18±2.91、28.0±2.20、28.78±3.54、32.08±3.22(P0.05)。 4.不同劑量細(xì)胞再生作用的結(jié)果。梗死區(qū)內(nèi)的α-SMA+細(xì)胞數(shù)分別為2.6±1.52、3.4±1.14、11.6±3.91、12.8±4.76、14.4±5.81(P0.05)；Ki-67+/α-SA+細(xì)胞數(shù)分別為1.00±0.82、2.14±1.35、5.00±1.15、5.86±1.77、6.71±1.11(P0.05)；TUNEL+細(xì)胞數(shù)分別為6.83±1.47、5.0±1.79、1.83±0.75、1.5±0.55、1.5±1.05(P0.05)。所有的結(jié)果都顯示出第二組較第一組有改善趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；第三、四和五組間隨細(xì)胞數(shù)量增加改善作用亦有上升趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；第三、四和五組均較第一和二組有明顯改善趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5.檢測(cè)心臟組織中的VEGF和SDF-1α表達(dá)。結(jié)果顯示細(xì)胞劑量較高的第三、四和五組含量明顯多于低劑量的第一組和對(duì)照組(P0.05),第三、四和五組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),對(duì)照組和第一組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),相對(duì)表達(dá)量灰度值比(與GAPDH相比)分別為VEGF:0.11±0.02、0.12±0.02、0.33±0.03、0.34±0.02、0.34±0.03(P0.05)：SDF-1:0.04±0.01、0.05±0.02、0.16±0.02、0.16±0.03、0.17±0.02(P0.05)。 結(jié)論 隨著移植細(xì)胞數(shù)量的增加,對(duì)梗死后心臟的改善作用增強(qiáng),但高于5×104移植細(xì)胞數(shù)量后,細(xì)胞數(shù)量的增加對(duì)心臟內(nèi)再生、分裂心肌細(xì)胞及凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量、梗死壁厚度及存活心肌數(shù)量和心功能的改善作用變化不大。因此我們推測(cè)在一定范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)量與所產(chǎn)生的作用成正比,達(dá)到平臺(tái)期的那個(gè)劑量是最佳劑量。就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言,小鼠心肌梗死模型中5×104是最佳劑量,該數(shù)量細(xì)胞指導(dǎo)下的人體試驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量為1.50×108。 第四部分直接心肌內(nèi)注射血小板纖維蛋白支架促進(jìn)內(nèi)源性修復(fù)和改善心梗后心臟功能的研究 研究背景 在所有非傳染性致死疾病中,心血管疾病占了首位,其中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病又是心血管疾病中最常見的一種。心肌梗死的最終結(jié)局極有可能是心功能衰竭,而其中大量心肌細(xì)胞的損失在心功能衰竭進(jìn)展中起著重要作用。目前常規(guī)的治療手段以緩解癥狀為主,治療效果有限。心臟移植雖能代替受損心臟,但供體難以獲取,臨床難以廣泛應(yīng)用,因此尋找新的方法從結(jié)構(gòu)和功能上替代死亡的心肌組織刻不容緩。新近組織工程和生物材料的發(fā)展為缺血性心臟病的治療或細(xì)胞血管成形術(shù)提供了很好的選擇�？勺⑸溆蒙锊牧峡梢酝ㄟ^(guò)微創(chuàng)的方式達(dá)到目標(biāo)位置,可以作為治療的載體或獨(dú)自成為一種治療手段。多種可注射用生物材料如纖維蛋白膠、膠原、藻酸鹽、基質(zhì)膠、自組織肽、細(xì)胞外基質(zhì)乳液、合成高分子水凝膠和微球等已經(jīng)用于心肌再生治療,且有了一定的效果。一種理想的用于缺血性心臟病治療的生物材料應(yīng)該具有以下特點(diǎn)：取材、制備簡(jiǎn)單;可注射,對(duì)患者的創(chuàng)傷很�。豢山到�,能夠適時(shí)為心臟修復(fù)提供支持；良好的生物兼容性,最好是來(lái)自于受體本身,這樣可不引起或引起很小的排異反應(yīng)；能夠?yàn)槭軗p心臟提供結(jié)構(gòu)和功能上的支持。血小板纖維蛋白支架具有上述特性,且未見在缺血性心臟中應(yīng)用的報(bào)道。 目的 本課題制備大鼠心肌梗死模型,將血小板纖維蛋白支架直接注射到梗死區(qū)域周圍,通過(guò)IHC法、ELISA法、超聲心動(dòng)圖、Masson染色等多種方法觀察血小板纖維蛋白支架在促進(jìn)梗死后心肌修復(fù)和改善心臟功能中的作用,探討血小板纖維蛋白支架在心肌梗死治療中的治療潛能,為缺血性心臟病的治療提供一個(gè)新方法。 方法 體外實(shí)驗(yàn)：從同品系大鼠腹主靜脈抽血并提取含有血小板的血漿,與溫?zé)岬腄MEM等體積混勻制膠。觀察血小板纖維蛋白支架的結(jié)構(gòu)形態(tài)特征；與新生大鼠心肌細(xì)胞混合培養(yǎng),觀察新生大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)及活性；用ELISA法檢測(cè)不同時(shí)間段血小板纖維蛋白支架條件培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子。體內(nèi)試驗(yàn)：利用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制備大鼠急性心肌梗死模型。分兩組觀察：第一組(DMEM組)在梗死區(qū)直接心肌注射PBS；第二組(血小板纖維蛋白支架組)在梗死區(qū)直接注射血小板纖維蛋白支架。注射部位在梗死區(qū)域周邊。微觀上觀察血小板纖維蛋白支架在心肌內(nèi)的降解特征,觀察新生心肌細(xì)胞、內(nèi)皮血管、毛細(xì)血管密度、募集內(nèi)源性修復(fù)、心肌細(xì)胞形態(tài)及炎癥反應(yīng)等情況；宏觀上觀察大鼠心肌梗死后心功能和大體形態(tài)的變化。 結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.含血小板血漿與DMEM混合,小于30s凝膠開始形成,120s內(nèi)完全成膠。HE染色可見血小板纖維蛋白支架成纖維樣結(jié)構(gòu),內(nèi)含血小板。 2. ELISA法檢測(cè)不同時(shí)間段條件培養(yǎng)基中VEGF、IGF-1和HGF的表達(dá),可見血小板纖維蛋白支架可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)活性細(xì)胞因子。 3.血小板纖維蛋白支架中大鼠新生心肌細(xì)胞形態(tài)和活性與常規(guī)條件培養(yǎng)下差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),這說(shuō)明血小板纖維蛋白支架無(wú)細(xì)胞毒性。 體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果 4.血小板纖維蛋白支架在體內(nèi)可以降解,第1天、第7天和第14天該膠的面積百分比分別為100.00%、(41.50±7.89)%和(10.47±5.45)%。 5.將血小板纖維蛋白支架和PBS注入梗死大鼠心臟后第7天時(shí),血小板纖維蛋白支架組較PBS組梗死區(qū)域中,心肌細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P0.0001)；內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P0.05)；凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P0.01)；c-Kit+細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P0.01)；CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P0.01),這說(shuō)明血小板纖維蛋白支架能夠促進(jìn)心肌再生,募集干細(xì)胞進(jìn)入梗死區(qū)域,且具有抗炎作用。 6.血小板纖維蛋白支架和PBS梗死區(qū)域注射后3周,血小板纖維蛋白支架組較PBS組梗死區(qū)域中,毛細(xì)血管密度明顯增加(P0.001)；IHC染色和分離心肌細(xì)胞ICC染色均發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞橫截面積面積明顯減小(P0.001和P0.05),這說(shuō)明血小板纖維蛋白支架能夠促進(jìn)局部血管的生成,增加血流供應(yīng),并且有效地減輕存活心肌的代償性肥大。 7.血小板纖維蛋白支架組和PBS組3周時(shí)Masson染色定量形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)血小板纖維蛋白支架組梗死區(qū)域室壁增厚(P0.05)；左心室腔面積減小(P0.05)；梗死區(qū)域周長(zhǎng)占左心室周長(zhǎng)的百分比降低(P0.05)。兩組大鼠心功能基線值相同(P0.05),但是3周時(shí)血小板纖維蛋白支架組心功能明顯優(yōu)于PBS組(P0.05)。這說(shuō)明血小板纖維蛋白支架能夠逆轉(zhuǎn)心肌梗死后心臟重塑,改善心臟功能。 結(jié)論 心肌內(nèi)注射自體血小板纖維蛋白支架可以通過(guò)增加新生心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量,增加毛細(xì)血管密度,啟動(dòng)募集內(nèi)源性修復(fù)系統(tǒng),減少梗死部位炎癥反應(yīng),維持正常的細(xì)胞形態(tài),從而改善心肌梗死后心臟功能,是缺血性心臟病治療和治療載體的理想選擇。 第五部分心臟干細(xì)胞與血小板纖維蛋白支架聯(lián)合移植在大鼠心肌梗死模型中的心臟再生研究 研究背景 可注射生物材料聯(lián)合干細(xì)胞,如骨髓細(xì)胞、脂肪源干細(xì)胞和骨髓源性誘導(dǎo)心臟干細(xì)胞被證實(shí)能夠改善心臟功能,而另一些研究則發(fā)現(xiàn)聯(lián)合細(xì)胞治療與單用生物材料治療心肌梗死最終的結(jié)果相似,究其原因無(wú)外乎生物材料和干細(xì)胞搭配的合理性。只有好的生物材料聯(lián)合好的干細(xì)胞種子,且兩者之間又能相互促進(jìn)才是好的選擇,也會(huì)對(duì)心肌梗死后心臟的修復(fù)起到更大作用。 近十年來(lái),隨著對(duì)心臟干細(xì)胞認(rèn)識(shí)的不斷加深,很多研究認(rèn)為心臟干細(xì)胞具有組織再生功能,在體內(nèi)能夠分化成為多種類型的成熟細(xì)胞,如心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等,因此用干細(xì)胞治療心肌梗死的研究引起了大家的普遍關(guān)注。CDCs是心臟干細(xì)胞中的一種,有實(shí)驗(yàn)證明CDCs較骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞以及骨髓單核細(xì)胞在心臟修復(fù)方面具有更大的優(yōu)勢(shì)。另外上一章中我們發(fā)現(xiàn)血小板纖維蛋白支架不僅具有良好的治療效果,而且與心臟組織有良好的的兼容性,因此我們推測(cè)血小板纖維蛋白支架和CDCs(?)昆合后,血小板纖維蛋白支架可以為CDCs提供良好的3D生長(zhǎng)系統(tǒng),這不僅使干細(xì)胞具有良好的生長(zhǎng)空間和微環(huán)境,而且還能夠延長(zhǎng)干細(xì)胞在心臟中的存留時(shí)間,有更加充裕的時(shí)間發(fā)揮作用；兩者相互作用,促進(jìn)心臟本身產(chǎn)生有利因子和CDCs發(fā)揮再生作用。 目的 本部分首先在體外研究血小板纖維蛋白支架與CDCs間的相互作用,再構(gòu)建大鼠心肌梗死模型,用血小板纖維蛋白支架聯(lián)合心臟干細(xì)胞移植,觀察對(duì)大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化,研究預(yù)先種植干細(xì)胞的生物材料是否具有更強(qiáng)的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。 方法 體外實(shí)驗(yàn)：從同品系大鼠腹主靜脈采血并提取含有血小板的血漿,與溫?zé)岬腄MEM等體積混勻制膠。觀察血小板纖維蛋白支架的結(jié)構(gòu)形態(tài)特征：CDCs在血小板纖維蛋白支架中的生長(zhǎng)狀況以及血小板纖維蛋白支架的降解。新生大鼠心肌細(xì)胞混合在含或不含CDCs的血小板纖維蛋白支架中培養(yǎng),觀察新生大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)及活性；采集不同時(shí)段血小板纖維蛋白支架的條件培養(yǎng)基用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子。體內(nèi)試驗(yàn)：利用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制備大鼠急性心肌梗死模型,分三3組：第1組(DMEM組)在梗死區(qū)直接心肌注射PBS；第二組(血小板纖維蛋白支架組,Gel組)在梗死區(qū)直接心肌注射血小板纖維蛋白支架；第三第3組(血小板纖維蛋白支架+CDCs組,Gel+CDCs組)。注射部位均在梗死區(qū)域周邊。微觀上觀察新生心肌細(xì)胞、內(nèi)皮血管、毛細(xì)血管密度、募集內(nèi)源性修復(fù)、肌細(xì)胞體積及炎癥反應(yīng)情況；宏觀上觀察大鼠心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)和功能。 結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.用ELISA法分析含和不含CDCs的血小板纖維蛋白支架的第2、5、9和14天的條件培養(yǎng)基中VEGF、IGF-1和SDF-1的含量,各時(shí)間點(diǎn)混合了CDCs的血小板纖維蛋白支架能夠分泌更多的細(xì)胞因子(P0.05) 2.觀察在血小板纖維蛋白支架中和常規(guī)條件下培養(yǎng)的CDCs擴(kuò)增數(shù)量(相對(duì)于12h的細(xì)胞數(shù)),結(jié)果發(fā)現(xiàn)12h時(shí)、第3天、第7天和第14天的細(xì)胞數(shù)量比較,兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示血小板纖維蛋白支架不影響CDCs細(xì)胞擴(kuò)增。第14天在血小板纖維蛋白支架中和在常規(guī)條件下生長(zhǎng)的CDCs長(zhǎng)短軸之比,前者明顯大于后者(P0.05)；再用LIVE/DEAD細(xì)胞活性／毒性試劑盒染色在血小板纖維蛋白支架中和在常規(guī)條件下的CDCs死亡細(xì)胞百分比,前者明顯小于后者(P0.05),這些說(shuō)明血小板纖維蛋白支架不僅能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),而且很好地保持了細(xì)胞活性。 3.為了評(píng)價(jià)體外血小板纖維蛋白支架的降解,我們?cè)?2h、第3天、第7天和第14天時(shí)測(cè)量血小板纖維蛋白支架中CDCs分布的"Z-distance"(評(píng)價(jià)血小板纖維蛋白支架的降解),結(jié)果發(fā)現(xiàn)14天后有將近2/3的支架降解。 4.用IHC法觀察培養(yǎng)第14天血小板纖維蛋白支架中CDCs,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDCs能夠分化成表達(dá)血管特異性標(biāo)志物α-SA、vWF和a-SMA的細(xì)胞。 5.在含有CDCs的血小板纖維蛋白支架和單純血小板纖維蛋白支架中培養(yǎng)的NRCMs,前者長(zhǎng)短軸之比明顯大于后者(P0.05),且跳動(dòng)MRCMs所占比例也明顯增多(P0.05),這說(shuō)明血小板纖維蛋白支架聯(lián)合CDCs能夠更好地促進(jìn)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)以及保持良好的活性。 體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果 6.制備大鼠心肌梗死模型,然后進(jìn)行CDCs或血小板纖維蛋白支架移植。定量分析Gel+CDCs組和Gel組中內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和c-Kit+細(xì)胞,結(jié)果前者明顯多于后者(P0.05),說(shuō)明含有CDCs的血小板纖維蛋白支架更加有利于心臟的再生。 7.分析Masson染色心臟冰凍切片,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gel+CDCs組梗死面積最小,梗死壁厚度最大(P0.05),說(shuō)明血小板纖維蛋白支架聯(lián)合CDCs移植能夠更好地逆轉(zhuǎn)心室負(fù)性重塑,改善心臟的結(jié)構(gòu)。 8.超聲心動(dòng)圖檢查3組大鼠術(shù)后左室射血分?jǐn)?shù)基線值相同(P0.05),說(shuō)明造模基本一致。3周后,在對(duì)照組中LVEF中進(jìn)行性下降,最大的LVEF值在Gel+CDCs組(P0.05),這說(shuō)明含有CDCs的血小板纖維蛋白支架從結(jié)構(gòu)上改變了梗死后心室,改善了梗死后心臟功能 9.定量分析CDCs直接再生的作用,Gel+CDCs組中的CM-DiI+心肌細(xì)胞僅占28.7%和27.3%,說(shuō)明血小板纖維蛋白支架聯(lián)合CDCs所起的作用中仍然以旁分泌為主。 結(jié)論 1.血小板纖維蛋白支架中有利于CDCs生長(zhǎng),且兩者聯(lián)合促進(jìn)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。 2.梗死后心肌內(nèi)注射含有CDCs的血小板纖維蛋白支架具有更好的保護(hù)作用。 3.血小板纖維蛋白支架聯(lián)合CDCs主要通過(guò)增加新生心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量,增加毛細(xì)血管密度,啟動(dòng)募集內(nèi)源性修復(fù)系統(tǒng),從而逆轉(zhuǎn)或停止心臟負(fù)性重塑,改善梗死后心臟功能,是缺血性心臟病治療的理想選擇。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R542.22;R-332

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 郭偉;梁遠(yuǎn)紅;靳立軍;;心臟肥大細(xì)胞與心肌梗死后心室重構(gòu)[J];國(guó)際心血管病雜志;2011年01期

2 陳波;陶正賢;趙英明;陳紅武;楊志健;;一種新型經(jīng)皮心肌注射器應(yīng)用于缺血性心臟病生物學(xué)治療的實(shí)驗(yàn)研究[J];醫(yī)藥論壇雜志;2011年19期

3 陳薈竹;郭應(yīng)坤;寧剛;;間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死的研究進(jìn)展[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2014年04期

4 郭英華;劉長(zhǎng)庭;何建國(guó);;粒細(xì)胞集落刺激因子聯(lián)合攜帶肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的BMSCs移植對(duì)心肌梗死大鼠血管重建的影響[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2011年06期

5 馬東宇;王邦寧;胡澤平;程源;陳大年;劉敏;曹中;宋兵;方楠;;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合纈沙坦對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的影響[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2013年10期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 石金錚;ST2和hs-CRP在急性冠脈綜合征中的診斷價(jià)值及其在急性心肌梗死后左室心肌重塑的機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2011年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 鮑勇;重組腺病毒—肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子治療對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌纖維化及心功能的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2012年

2 馬東宇;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合纈沙坦對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：2586537