【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是結(jié)核病的病原體,全世界大約有1/3人口感染或攜帶這種桿菌。從上世紀(jì)末開(kāi)始,由于耐多藥甚至廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)使已經(jīng)得到控制的結(jié)核病發(fā)病率又呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。因此,尋找新的抗結(jié)核藥物的靶點(diǎn)是當(dāng)前結(jié)核病研究的主要任務(wù)之一。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu),對(duì)于維持細(xì)胞的生存和繁殖有非常重要的作用。其細(xì)胞壁的核心結(jié)構(gòu)由三種大分子組成,由外至內(nèi)分別為分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖。其中聚阿拉伯半乳糖與肽聚糖之間是通過(guò)L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺(L-rhamnose-D-N-GlcNAc)銜接雙糖共價(jià)連接起來(lái)的,這個(gè)銜接雙糖對(duì)于維持結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的完整性有極其重要的作用。 L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖合成的第一步反應(yīng)是將糖基供體UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸(GlcNAc-1-P)基團(tuán)轉(zhuǎn)移到脂類(lèi)載體C50-P(Decaprenyl phosphaye)上形成C50-P-P-GlcNAc,此反應(yīng)由N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶催化完成。N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)于銜接雙糖的合成有至關(guān)重要的作用,一旦該酶被抑制或缺失,銜接雙糖將不能合成。 在大腸桿菌中wecA基因編碼的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(WecA)參與脂多糖(LPS)中O-抗原多糖的合成。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)大腸桿菌wecA基因敲除菌株MV501中LPS合成的補(bǔ)償實(shí)驗(yàn),證實(shí)了結(jié)核分枝桿菌Rv1302基因是WecA的編碼基因wecA;并構(gòu)建了恥垢分枝桿菌wecA基因敲除菌株,通過(guò)測(cè)定其生長(zhǎng)曲線和使用電鏡觀察其形態(tài)學(xué)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化,證明了wecA是分枝桿菌生長(zhǎng)必需基因。由此可見(jiàn),WecA是研發(fā)抗結(jié)核藥物的一個(gè)非常好的潛在靶點(diǎn)。 通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌WecA的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),WecA是一個(gè)具有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,難于在E. coli宿主細(xì)胞中獲得高表達(dá)的WecA膜蛋白,也不便對(duì)WecA膜蛋白進(jìn)行純化。 目的: 1.用pET16b-Tb wecA表達(dá)載體在E. coli ER2566菌株中表達(dá)WecA膜蛋白并進(jìn)行純化;2.建立WecA酶活性分析方法,分別使用薄層層析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)技術(shù)對(duì)WecA酶活性進(jìn)行鑒定;3.嘗試WecA膜蛋白表達(dá)的其它方法,包括構(gòu)建pCold-Tb wecA表達(dá)載體,在E. coli MV501菌株中低溫誘導(dǎo)WecA膜蛋白的表達(dá);獲取刪除5’端的wecA基因,構(gòu)建pET29b-Tb wecA del1和pET29b-Tb wecA del2表達(dá)載體,在多種大腸桿菌表達(dá)菌株中表達(dá)N末端截短的WecA膜蛋白;使用MembraneMax Protein Expression Kit在體外表達(dá)WecA膜蛋白。 結(jié)果: 1.用pET16b-Tb wecA表達(dá)載體在E. coli ER2566菌株中表達(dá)WecA膜蛋白并純化出WecA膜蛋白 在25℃條件下用終濃度1 mM的IPTG誘導(dǎo)pET16b-Tb wecA/ER2566生長(zhǎng)16 h。用超聲方法破碎誘導(dǎo)后的細(xì)菌,提取細(xì)胞膜組分,用去污劑n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷(n-Dodecyl-β-D-maltoside, DDM)溶解膜蛋白,將樣品分別進(jìn)行Dot blot,SDS-PAGE和Western blot分析。從pET16b-Tb wecA/ER2566的膜組分中能夠檢測(cè)到表達(dá)的WecA蛋白。 用鎳-組氨酸親和層析法對(duì)帶有N-末端組氨酸標(biāo)簽的WecA融合蛋白進(jìn)行純化,對(duì)純化的WecA蛋白進(jìn)行酶活性分析。 2.建立了WecA酶活性分析方法 (1)WecA酶活性檢測(cè):TLC法 將底物C50-P和UDP-GlcNAc與純化的WecA蛋白共同孵育,用氯仿/甲醇/氨水抽提有機(jī)相并真空干燥。用氯仿溶解樣品后,將樣品點(diǎn)在TLC板上進(jìn)行層析,用磷鉬酸對(duì)脂類(lèi)進(jìn)行顯色,通過(guò)底物C50-P的消耗量和產(chǎn)物C50-P-P-GlcNAc的生成量來(lái)確定WecA酶活性。結(jié)果顯示,用TLC法檢測(cè)到了純化的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。 (2)WecA酶活性檢測(cè):HPLC法 將反應(yīng)底物C50-P和UDP-GlcNAc和純化的WecA蛋白共同孵育,用氯仿/甲醇/氨水萃取反應(yīng)液,對(duì)水相進(jìn)行HPLC檢測(cè),通過(guò)底物UDP-GlcNAc的減少量來(lái)確定WecA酶活性。結(jié)果顯示,純化的WecA蛋白與底物共同孵育后,底物UDP-GlcNAc有了明顯的消耗,峰面積減小了約20%,由此進(jìn)一步證明了所純化的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。 3.嘗試了WecA膜蛋白表達(dá)的其它方法 (1)以pCold-Tb wecA為表達(dá)載體,低溫誘導(dǎo)WecA膜蛋白在E. coli MV501菌株中的表達(dá) 用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切pET16b-Tb wecA質(zhì)粒,將Tb wecA基因克隆到pColdⅡ載體的NdeⅠ和BamHⅠ位點(diǎn),構(gòu)建出pCold-Tb wecA表達(dá)質(zhì)粒。所構(gòu)建的pCold-Tb wecA載體具有冷休克基因cspA啟動(dòng)子,便于在低溫誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,提高蛋白的可溶性和穩(wěn)定性。此外該載體還具有N-末端組氨酸標(biāo)簽序列,表達(dá)WecA融合蛋白,便于蛋白的檢測(cè)和純化。 在15℃條件下用終濃度1 mM的IPTG誘導(dǎo)WecA蛋白的表達(dá)。將上清組分、沉淀組分和膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE及Western blot分析。結(jié)果表明,從pCold-Tb wecA/MV501的膜蛋白組分中能夠檢測(cè)到表達(dá)的WecA蛋白。 (2)N端截短的WecA膜蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)根據(jù)wecA全基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,用PCR方法獲得刪除N末端1個(gè)跨膜區(qū)的基因Tb wecA del1及刪除N末端3個(gè)跨膜區(qū)的基因Tb wecA del2,構(gòu)建pMD18-Tb wecA del1和pMD18-Tb wecA del2克隆載體,并對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。 用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切pMD18-Tb wecA del1和pMD18-Tb wecA del2克隆質(zhì)粒,分別將Tb wecA del1和Tb wecA del2基因片段連接到pET29b載體,構(gòu)建pET29b-Tb wecA del1和pET29b-Tb wecA del2表達(dá)質(zhì)粒。截短的WecA蛋白(WecA del1和WecA del2)的C-末端與組氨酸標(biāo)簽融合,便于截短蛋白的檢測(cè)和純化。 分別將pET29b-Tb wecA del1和pET29b-Tb wecA del2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)、CD41(DE3)和ER2566菌株中,在37℃條件下用終濃度為1 mM的IPTG誘導(dǎo)WecA截短蛋白的表達(dá)。將上清、沉淀組分和膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析,在各組分中沒(méi)有檢測(cè)到WecA截短蛋白的表達(dá),說(shuō)明N末端的氨基酸序列可能對(duì)維持WecA蛋白的結(jié)構(gòu)十分重要。 (3)WecA膜蛋白的體外表達(dá) 分別將pET16b-wecA,pET29b-wecA del1及pET29b-wecA del2質(zhì)粒作為模板加入到體外表達(dá)系統(tǒng)(MembraneMax Protein Expression Kit)中,經(jīng)過(guò)30 min的起始反應(yīng)和2 h的補(bǔ)充反應(yīng)后,將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析以及WecA酶活性鑒定,但尚未獲得足夠量有活性的WecA全長(zhǎng)或截短膜蛋白。對(duì)WecA膜蛋白的體外表達(dá)條件需進(jìn)一步優(yōu)化。 結(jié)論: 1.以pET16b-Tb wecA質(zhì)粒為表達(dá)載體,在E. coli ER2566細(xì)胞中表達(dá)了WecA膜蛋白,并對(duì)WecA蛋白進(jìn)行了純化。 2.建立了WecA酶活性分析方法,分別利用TLC和HPLC檢測(cè)到了純化的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶活性,從酶學(xué)角度進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)核分枝桿菌Rv1302基因就是N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(WecA)的編碼基因wecA,同時(shí)也為進(jìn)一步研究該酶的催化特性奠定了基礎(chǔ)。 3.嘗試了表達(dá)WecA膜蛋白的其它方法:用pCold-Tb wecA表達(dá)載體在E. coli MV501菌株中表達(dá)了WecA膜蛋白,但表達(dá)量沒(méi)有提高;構(gòu)建了pET29b-Tb wecA del1和pET29b-Tb wecA del2兩個(gè)表達(dá)載體,并分別使用三種E. coli表達(dá)菌株嘗試表達(dá)WecA截短蛋白,但尚未獲得WecA截短蛋白,說(shuō)明N末端氨基酸序列對(duì)WecA蛋白有重要作用;初步嘗試了體外表達(dá)WecA膜蛋白的方法。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2586614