發(fā)布時(shí)間：2020-03-11 05:33

【摘要】：目的： 建立特異、快速、敏感的實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線基因分型方法,并探討該法在臨床痰標(biāo)本和環(huán)境水樣中鑒定嗜肺軍團(tuán)茵的應(yīng)用價(jià)值。 方法： (1)根據(jù)嗜肺軍團(tuán)菌16S rRNA基因保守序列設(shè)計(jì)引物和淬滅FRET探針建立實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線方法。 (2)優(yōu)化引物與探針濃度,用嗜肺軍團(tuán)菌、非嗜肺軍團(tuán)菌及其他病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性,并做模擬實(shí)驗(yàn)。 (3)117份痰標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線法鑒定,鑒定結(jié)果通過基因測序法檢測結(jié)果驗(yàn)證。 (4)對(duì)18份環(huán)境水樣進(jìn)行培養(yǎng),生化表型,普通PCR,實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線鑒定,鑒定結(jié)果通過基因測序法檢測結(jié)果驗(yàn)證。 結(jié)果： (1)引物序列：上游引物5'-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3'.下游引物5'-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3'。探針序列：錨定探針序列5'-CCCATACTCGAGTCAACC (FAM)-3',感應(yīng)探針序列5'-(BHQ1) TATTATCTGACCGTCCCA G (ph)-3' (2)優(yōu)化后的反應(yīng)體系：10×PCR酶體系15.5μ1,上游引物(40.0pmol/μL)1.0μl,下游引物(2.0pmol/.μl)2.0μl,錨定探針(10pmol/μl)1.0μl,感應(yīng)探針(10pmol/μl)0.5μl,模板5μ1。 優(yōu)化后的反應(yīng)程序：(Roche Lightcycler480實(shí)時(shí)熒光PCR儀)95℃3min:95℃10s,57℃20s,72℃30s,50個(gè)循環(huán);熔解分析程序?yàn)?5℃1min:40℃2min40℃升溫至85℃,1℃/5s。FAM通道下檢測熒光。 使用實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線基因分型方法檢測的15株嗜肺軍團(tuán)菌、30株非嗜肺軍團(tuán)茵、7株其他病原菌中,15株不同血清型的嗜肺軍團(tuán)菌Tm值均為57℃;7株非嗜肺軍團(tuán)菌Tm值為43℃,1株Tm值為45℃；其余22株非嗜肺軍團(tuán)菌和7株其他病原茵均無明顯Tm值。該方法檢測的靈敏度可達(dá)100fg/μl。 (3)117例痰標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌陽性。 117例痰標(biāo)本中經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線基因法檢測,發(fā)現(xiàn)有3例嗜肺軍團(tuán)茵,與基因測序法檢測結(jié)果一致。 (4)環(huán)境水樣經(jīng)培養(yǎng),得到可疑軍團(tuán)菌22株,經(jīng)普通PCR鑒定,發(fā)現(xiàn)20株軍團(tuán)菌陽性。 環(huán)境水樣經(jīng)培養(yǎng),22株可疑軍團(tuán)菌菌株經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線法鑒定嗜肺軍團(tuán)菌陽性的菌株共9株。與基因測序法檢測結(jié)果一致。 環(huán)境水樣直接提取DNA,普通PCR后軍團(tuán)菌陽性的標(biāo)本：4號(hào),5號(hào),8號(hào),9號(hào),13號(hào),14號(hào).15號(hào).16號(hào),17號(hào),18號(hào),經(jīng)基因測序法驗(yàn)證后,進(jìn)一步顯示5、9號(hào)標(biāo)本為嗜肺軍團(tuán)菌,13、14、15號(hào)標(biāo)本為辛辛那提軍團(tuán)菌,16、17、18號(hào)標(biāo)本為長灘軍團(tuán)菌。 環(huán)境水樣直接提取DNA、實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線法鑒定嗜肺軍團(tuán)菌陽性標(biāo)本：未發(fā)現(xiàn)陽性標(biāo)本。 結(jié)論： (1)建立的實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線法能夠明確的對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌鑒定,并可對(duì)部分軍團(tuán)菌進(jìn)行分型。 (2)在對(duì)117例臨床標(biāo)本的鑒定中,檢測出3例嗜肺軍團(tuán)菌,鑒定結(jié)果與PCR-基因測序方法一致。 (3)對(duì)環(huán)境水樣檢測過程中,通過采用分離培養(yǎng)、生化表型、實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線法、基因測序方法的鑒定,發(fā)現(xiàn)環(huán)境水源能分離出軍團(tuán)菌,對(duì)分離菌株進(jìn)一步的分型和鑒定,可采用實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線法、基因測序方法。 (4)實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線法除具有傳統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光PCR高靈敏、高特異性、高精確度及污染小等優(yōu)點(diǎn)外，，淬滅探針熒光標(biāo)記技術(shù)要求低,價(jià)格更便宜,耗時(shí)短,因此,該方法更適用于軍團(tuán)菌病的預(yù)防和臨床診斷,尤其是在軍團(tuán)菌病暴發(fā)流行時(shí),可提供快速的實(shí)驗(yàn)室診斷。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 盧一凡,鄧?yán)^先,肖成祖,馬清鈞;一種快速鑒定轉(zhuǎn)基因鼠的方法[J];生命科學(xué)研究;1998年04期

2 許蕾,徐磊,李學(xué)禮,呂立夏,談潔,王堯;PCR介導(dǎo)化學(xué)合成廣譜細(xì)胞生長因子基因半分子[J];上海鐵道大學(xué)學(xué)報(bào);1999年01期

3 蔣正軍,龔振華,尹燕博,王樹雙,蔡麗娟,郭福生,陸明哲,孫承英,宣華;應(yīng)用PCR檢測非洲豬瘟病毒的研究[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2000年S1期

4 張晚鳴,馬立新;土曲霉CCTCCAF93044植酸酶基因的克隆及序列分析[J];湖北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2001年02期

5 劉忠權(quán),周材權(quán),王義權(quán),周開亞;分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在中藥材鑒定中的應(yīng)用[J];世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化;2001年05期

6 彭穎,熊漢華,黃慶華,熊薇,許迪,葉嗣穎;幽門螺桿菌全長基因cagA擴(kuò)增及限制性酶切片段多態(tài)性研究[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2001年03期

7 張巍,沈倍奮,黎燕,郭寧,馮健男;用一種新型的PCR方法快速制備人TNF-α缺失突變體[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2002年05期

8 帥小蓉,夏慶友,朱勇;定量PCR技術(shù)的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用概述[J];蠶學(xué)通訊;2002年04期

9 張為民,張安世;PCR技術(shù)簡介及其應(yīng)用[J];河南教育學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2002年03期

10 張巍,沈倍奮;一種快速簡便的定點(diǎn)突變方法[J];免疫學(xué)雜志;2003年S1期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 譚詩文;余波;冉懋韜;蔡一鳴;艾玉萍;王璇;張華;;牛源HBV套式PCR方法建立及其S靶基因同源性分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

2 王平;王輝;許文兵;朱元玨;;肺組織結(jié)核分枝桿菌巢式PCR快速檢測[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)年會(huì)——2011（第十二次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議）論文匯編[C];2011年

3 回文廣;趙廷昌;孫福在;張卉;王建榮;高孝強(qiáng);田麗;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理及其應(yīng)用[A];中國植物病理學(xué)會(huì)第六屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集——植物病理學(xué)研究進(jìn)展（第五卷）[C];2003年

4 張?zhí)?凌宗帥;徐彪;梁成珠;朱來華;孫軍;王洪兵;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測豬流感病毒方法的建立[A];動(dòng)物檢疫學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2010年

5 吳馳;張紅梅;詹能勇;鄧永聰;單萬水;余衛(wèi)業(yè);;熒光定量PCR技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的臨床應(yīng)用研究[A];2010年中國防癆協(xié)會(huì)臨床/基礎(chǔ)專業(yè)學(xué)術(shù)大會(huì)匯編[C];2010年

6 周素娟;張鐵軍;何納;;HCV的C/E1區(qū)PCR擴(kuò)增方法的改進(jìn)[A];華東地區(qū)第十次流行病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨華東地區(qū)流行病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議20周年慶典論文集[C];2010年

7 李青;鐘青萍;王麗;;海產(chǎn)品中副溶血弧菌的PCR快速檢測方法的建立[A];“食品加工與安全”學(xué)術(shù)研討會(huì)暨2010年廣東省食品學(xué)會(huì)年會(huì)論文集[C];2010年

8 陳信忠;任聰;龔艷清;王壽昆;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測對(duì)蝦白斑綜合征病毒[A];經(jīng)濟(jì)發(fā)展方式轉(zhuǎn)變與自主創(chuàng)新——第十二屆中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)年會(huì)（第三卷）[C];2010年

9 潘康成;馮興;崔恒敏;張亞蘭;趙爽;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測雞口服枯草芽孢桿菌后腸道芽孢桿菌數(shù)量變化[A];第四屆第十次全國學(xué)術(shù)研討會(huì)暨動(dòng)物微生態(tài)企業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略論壇論文集（下冊）[C];2010年

10 孫秋影;盧長春;魏強(qiáng);龐淑芬;;LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀在獻(xiàn)血者血液篩查中的應(yīng)用[A];中國輸血協(xié)會(huì)第五屆輸血大會(huì)論文專集（摘要篇）[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 通文;Bio—Rad公司推出快速定量PCR反應(yīng)液[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

2 通言;ABI實(shí)時(shí)定量PCR儀獲準(zhǔn)與rRT—PCR Flu Panel聯(lián)用[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

3 郭偉立;實(shí)時(shí)、個(gè)體、高效[N];中國醫(yī)藥報(bào);2011年

4 記者 瞿劍;豬是否“感冒”五小時(shí)見分曉[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

5 《金周刊》記者 朱杰;羅氏為何青睞深圳匹基[N];中國經(jīng)營報(bào);2001年

6 《金周刊》記者 朱杰 新華社記者 王璐;記者調(diào)查廣州達(dá)安造假內(nèi)幕[N];中國經(jīng)營報(bào);2001年

7 記者 張平陽 楊斌鵠;快速檢測甲流 西安批量生產(chǎn)關(guān)鍵設(shè)備[N];西安日?qǐng)?bào);2009年

8 劉又寧;關(guān)于“非典”幾個(gè)問題的思考[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2003年

9 季愛華;飼料中牛羊源性成分測定新法通過審定[N];中國食品報(bào);2009年

10 衛(wèi)敏;新大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的臨床應(yīng)用[N];中國醫(yī)藥報(bào);2000年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張?jiān)谄?熒光定量PCR檢測禽白血病病毒與RNA干擾抑制J亞群禽白血病病毒復(fù)制的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 渠柏艷;基于血液樣品和微流控芯片技術(shù)的細(xì)胞分離、PCR擴(kuò)增及DNA測序方法研究[D];東北大學(xué);2009年

3 張麗;實(shí)時(shí)定量PCR檢測兒童急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARα融合基因[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

4 李澤松;缺失型α-地中海貧血基因診斷芯片及在分子流行病學(xué)研究中的應(yīng)用[D];重慶大學(xué);2008年

5 陳智勇;胰腺癌相關(guān)基因mucin4的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

6 王彥君;細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4基因微衛(wèi)星多態(tài)性與炎癥性腸病相關(guān)性研究[D];吉林大學(xué);2008年

7 馬孟根;豬源致病性沙門氏菌耐藥基因PCR和基因芯片檢測技術(shù)研究[D];四川大學(xué);2005年

8 肖性龍;多重?zé)晒釶CR與液相芯片高通量病原體檢測體系的建立與應(yīng)用[D];華南理工大學(xué);2010年

9 夏乾峰;二聚體突變引物定量PCR技術(shù)的研發(fā)及其臨床應(yīng)用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

10 劉國棟;基于胃黏膜多重Real time PCR的幽門螺桿菌根除藥物選擇技術(shù)的建立與評(píng)價(jià)[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 戈立秀;實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線法快速鑒定嗜肺軍團(tuán)菌[D];天津醫(yī)科大學(xué);2012年

2 王穩(wěn);利用RT-PCR驗(yàn)證基于小鼠外顯子芯片發(fā)現(xiàn)的腦缺血相關(guān)基因表達(dá)的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

3 劉新軍;表達(dá)布氏桿菌sodc基因的重組沙門氏菌的構(gòu)建及不同種布氏桿菌鑒別PCR檢測方法的建立[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 郭世奎;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)結(jié)直腸癌患者腸道微生態(tài)的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

5 金戈;博爾納病病毒磷蛋白的原核表達(dá)和p24片段熒光定量PCR試劑盒的研制開發(fā)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

6 劉志國;實(shí)時(shí)多重?zé)晒釶CR快速鑒別布魯菌方法的建立[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

7 鄭升博;豬鏈球菌多重PCR檢測方法的建立及屠宰場樣品感染率的調(diào)查研究[D];上海交通大學(xué);2010年

8 劉寧;PCR擴(kuò)增16srRNA基因以快速診斷敗血癥及分型細(xì)菌[D];南昌大學(xué);2010年

9 陳晶晶;不同納米材料對(duì)PCR優(yōu)化作用的研究及機(jī)制探討[D];東華大學(xué);2011年

10 譚景尹;PCR—膜芯片~(?)技術(shù)檢測結(jié)核桿菌耐藥基因突變的應(yīng)用研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2586205