【摘要】：[目的]從既往單采漿HIV-1慢性感染者中篩選有廣譜中和活性的樣本；克隆廣譜中和活性樣本的包膜蛋白基因并進(jìn)行功能鑒定,分析獲得的功能性env基因所制備的假病毒顆粒的中和特征,以構(gòu)建適用于中和抗體評(píng)價(jià)用的假病毒顆粒；初步探討廣譜中和活性樣本env基因的序列特征,分析特殊位點(diǎn)基因序列變異對(duì)毒株中和特性的影響,為進(jìn)一步的廣譜中和性單克隆抗體的分離、表位鑒定和疫苗免疫原設(shè)計(jì)提供參考信息。 [方法]本研究中應(yīng)用代表A、B、C、B/C、A/E等不同亞型或流行重組型的25株假病毒通過假病毒單輪感染TZM-bl中和抗體分析技術(shù),從我國既往單采漿HIV-1慢性感染者中篩選有廣潛中和活性的樣本。從廣譜中和活性樣本血漿提取病毒RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增獲得cDNA,再用巢式PCR擴(kuò)增獲得env基因。將env基因擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后克隆到pcDNATM3.1 D/V5-His-TOPO載體,轉(zhuǎn)化后挑取菌落進(jìn)行菌落PCR和酶切鑒定,并制備假病毒進(jìn)行功能篩選,對(duì)功能性假病毒進(jìn)行中和敏感性測(cè)定。初步分析廣譜中和活性樣本env基因的序列特征,包括V3區(qū)序列、可變區(qū)和恒定區(qū)序列、糖基化位點(diǎn)以及特殊位點(diǎn)基因序列變異對(duì)中和特性的影響,進(jìn)行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。 [結(jié)果]通過假病毒單輪感染TZM-bl中和抗體分析技術(shù)篩選獲得了3份具有廣譜中和活性的樣本(CBJC524、CBJC438、CBJV521)。這三份樣本在體外中和實(shí)驗(yàn)中均能中和所用25個(gè)毒株的80%以上,其中對(duì)B亞型的中和寬度最大,對(duì)8個(gè)測(cè)試毒株都表現(xiàn)了不同程度的中和活性,對(duì)AE亞型病毒株的中和能力最弱,對(duì)其他亞型毒株的中和活性介于B亞型和AE亞型病毒株之間。本研究結(jié)果顯示極少部分篩查樣本能夠產(chǎn)生廣譜中和抗體活性,導(dǎo)致這些感染者產(chǎn)生廣譜中和抗體的機(jī)制目前仍不清楚。通過功能篩選從3個(gè)樣本(CBJC524、CBJC438、CBJV521)中各獲得1個(gè)具有較高活性的質(zhì)粒,構(gòu)建的3個(gè)假病毒的半數(shù)組織感染量(TCID50)分別為781250、3906250、3906250 TCID50/ml。這：三個(gè)假病毒對(duì)自體血漿均表現(xiàn)一定的中和敏感性。三個(gè)假病毒均對(duì)4E10和和SCD4敏感。自感染者CBJC438制備的假病毒對(duì)IgGlbl2的中和敏感,中和50%病毒(IC50)的抗體濃度約為1.43μg/ml,另兩個(gè)對(duì)此抗體的中和有抗性。自感染者CBJC524制備的假病毒對(duì)2G12的中和非常敏感,中和50%病毒(IC50)的抗體濃度約0.13μg/ml,另兩個(gè)感染者制備的假病毒都對(duì)2G12的中和有抗性。自感染者CBJC438和CBJC521樣本制符的假病毒對(duì)2F5的中和能力一般,IC50分別為13.05μg/ml、10.67μg/ml,感染者CBJC524制備的假病毒對(duì)2F5的中和有抗性。同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明這3份廣譜中和樣本擴(kuò)增的HIV-1膜蛋白基因均屬于B型。本研究結(jié)果也提示env基因的點(diǎn)突變和PNGSs的出現(xiàn)或位置改變可導(dǎo)致病毒的中和敏感性發(fā)生變化,與中和特征相關(guān)的突變散布于env基因中 [結(jié)論]應(yīng)用假病毒單輪感染TZM-bl中和抗體測(cè)定方法篩選獲得了3份含廣譜中和活性的HIV-1感染樣品。從3份含廣譜中和活性HIV-1感染樣品構(gòu)建并各篩選出一株功能較強(qiáng)的env基因,通過假病毒對(duì)血漿樣品或單克隆抗體中和敏感性分析,表明這3個(gè)假病毒可以用于中和抗體的評(píng)價(jià)和env基因生物學(xué)特征的研究。對(duì)廣譜中和活性樣本中env基因序列初步分析結(jié)果顯示個(gè)體內(nèi)病毒env序列具有高度同源性,gp120 V3區(qū)氨基酸高度保守,研究結(jié)果也提示env基因的點(diǎn)突變或糖基化位點(diǎn)的改變可能與中和敏感性相關(guān)。構(gòu)建系列突變體對(duì)研究中觀察到的基因序列變化與中和敏感性間的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)分析將有助于確定引起中和敏感性發(fā)生改變的序列特征。廣譜中和活性HIV-1感染樣品的獲得和功能性膜蛋白基因的克隆鑒定為進(jìn)一步分離廣譜中和性單克隆抗體,深入研究其識(shí)別表位,以設(shè)計(jì)更有效的疫苗免疫原提供了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖3.三個(gè)樣本對(duì)不同亞型病毒的中和活性A:三個(gè)樣本對(duì)HIV-IA亞型病毒株的中和活性B:三個(gè)樣本對(duì)HIV-IB亞型病毒株的中和活性c:三個(gè)樣本對(duì)HIV-IC亞型病毒株的中和活性Fig.3NeutraliZationactivitiesofthreesamPlestodistinetsubtyPevrius

2.3酉每切鑒定結(jié)果取轉(zhuǎn)化克隆搖菌提取質(zhì)粒，曰腸01和及m7HI圖7所示，!沂得 :250bP gp16OJ淺l天I片段長(zhǎng)為 3000bp，雙酶切鑒定插入片段的大小，，如，JrU土期(}勺人小一致。朽OObp3。的bp圖7重組質(zhì)粒的酶[IJ分析 F19.7ReeorllbinantPlasrniddigestedby肋 01andBaznHlM:Marke DNALadde:Marker(_[到卜條帶分別為4500、3000、2250、1500、1000、750、500、250)
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2585868