【摘要】：[目的]從既往單采漿HIV-1慢性感染者中篩選有廣譜中和活性的樣本；克隆廣譜中和活性樣本的包膜蛋白基因并進行功能鑒定,分析獲得的功能性env基因所制備的假病毒顆粒的中和特征,以構(gòu)建適用于中和抗體評價用的假病毒顆粒；初步探討廣譜中和活性樣本env基因的序列特征,分析特殊位點基因序列變異對毒株中和特性的影響,為進一步的廣譜中和性單克隆抗體的分離、表位鑒定和疫苗免疫原設計提供參考信息。 [方法]本研究中應用代表A、B、C、B/C、A/E等不同亞型或流行重組型的25株假病毒通過假病毒單輪感染TZM-bl中和抗體分析技術(shù),從我國既往單采漿HIV-1慢性感染者中篩選有廣潛中和活性的樣本。從廣譜中和活性樣本血漿提取病毒RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增獲得cDNA,再用巢式PCR擴增獲得env基因。將env基因擴增產(chǎn)物回收純化后克隆到pcDNATM3.1 D/V5-His-TOPO載體,轉(zhuǎn)化后挑取菌落進行菌落PCR和酶切鑒定,并制備假病毒進行功能篩選,對功能性假病毒進行中和敏感性測定。初步分析廣譜中和活性樣本env基因的序列特征,包括V3區(qū)序列、可變區(qū)和恒定區(qū)序列、糖基化位點以及特殊位點基因序列變異對中和特性的影響,進行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。 [結(jié)果]通過假病毒單輪感染TZM-bl中和抗體分析技術(shù)篩選獲得了3份具有廣譜中和活性的樣本(CBJC524、CBJC438、CBJV521)。這三份樣本在體外中和實驗中均能中和所用25個毒株的80%以上,其中對B亞型的中和寬度最大,對8個測試毒株都表現(xiàn)了不同程度的中和活性,對AE亞型病毒株的中和能力最弱,對其他亞型毒株的中和活性介于B亞型和AE亞型病毒株之間。本研究結(jié)果顯示極少部分篩查樣本能夠產(chǎn)生廣譜中和抗體活性,導致這些感染者產(chǎn)生廣譜中和抗體的機制目前仍不清楚。通過功能篩選從3個樣本(CBJC524、CBJC438、CBJV521)中各獲得1個具有較高活性的質(zhì)粒,構(gòu)建的3個假病毒的半數(shù)組織感染量(TCID50)分別為781250、3906250、3906250 TCID50/ml。這：三個假病毒對自體血漿均表現(xiàn)一定的中和敏感性。三個假病毒均對4E10和和SCD4敏感。自感染者CBJC438制備的假病毒對IgGlbl2的中和敏感,中和50%病毒(IC50)的抗體濃度約為1.43μg/ml,另兩個對此抗體的中和有抗性。自感染者CBJC524制備的假病毒對2G12的中和非常敏感,中和50%病毒(IC50)的抗體濃度約0.13μg/ml,另兩個感染者制備的假病毒都對2G12的中和有抗性。自感染者CBJC438和CBJC521樣本制符的假病毒對2F5的中和能力一般,IC50分別為13.05μg/ml、10.67μg/ml,感染者CBJC524制備的假病毒對2F5的中和有抗性。同源性比較及系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明這3份廣譜中和樣本擴增的HIV-1膜蛋白基因均屬于B型。本研究結(jié)果也提示env基因的點突變和PNGSs的出現(xiàn)或位置改變可導致病毒的中和敏感性發(fā)生變化,與中和特征相關(guān)的突變散布于env基因中 [結(jié)論]應用假病毒單輪感染TZM-bl中和抗體測定方法篩選獲得了3份含廣譜中和活性的HIV-1感染樣品。從3份含廣譜中和活性HIV-1感染樣品構(gòu)建并各篩選出一株功能較強的env基因,通過假病毒對血漿樣品或單克隆抗體中和敏感性分析,表明這3個假病毒可以用于中和抗體的評價和env基因生物學特征的研究。對廣譜中和活性樣本中env基因序列初步分析結(jié)果顯示個體內(nèi)病毒env序列具有高度同源性,gp120 V3區(qū)氨基酸高度保守,研究結(jié)果也提示env基因的點突變或糖基化位點的改變可能與中和敏感性相關(guān)。構(gòu)建系列突變體對研究中觀察到的基因序列變化與中和敏感性間的關(guān)系進行系統(tǒng)分析將有助于確定引起中和敏感性發(fā)生改變的序列特征。廣譜中和活性HIV-1感染樣品的獲得和功能性膜蛋白基因的克隆鑒定為進一步分離廣譜中和性單克隆抗體,深入研究其識別表位,以設計更有效的疫苗免疫原提供了基礎。
【圖文】：

圖3.三個樣本對不同亞型病毒的中和活性A:三個樣本對HIV-IA亞型病毒株的中和活性B:三個樣本對HIV-IB亞型病毒株的中和活性c:三個樣本對HIV-IC亞型病毒株的中和活性Fig.3NeutraliZationactivitiesofthreesamPlestodistinetsubtyPevrius

2.3酉每切鑒定結(jié)果取轉(zhuǎn)化克隆搖菌提取質(zhì)粒，曰腸01和及m7HI圖7所示，!沂得 :250bP gp16OJ淺l天I片段長為 3000bp，雙酶切鑒定插入片段的大小，，如，JrU土期(}勺人小一致。朽OObp3。的bp圖7重組質(zhì)粒的酶[IJ分析 F19.7ReeorllbinantPlasrniddigestedby肋 01andBaznHlM:Marke DNALadde:Marker(_[到卜條帶分別為4500、3000、2250、1500、1000、750、500、250)
【學位授予單位】：昆明醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：2585868