【摘要】：BST2(Bone Marrow Stromal Antigen2)骨髓基質(zhì)細胞抗原2，又被稱為CD317，HM1.24或者tetherin，是天然免疫中針對囊膜病毒的應(yīng)答因子。BST2的cDNA是從由風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎衍生出的一種滑液細胞系中克隆出來，當(dāng)時被認為BST2蛋白參與了前體B細胞生長。BST2能夠?qū)pu蛋白缺失的HIV-1病毒粒子拴在細胞膜上，阻止病毒的釋放，BST2因此被命名為“tetherin”。BST2對囊膜病毒的出膜具有廣譜的抑制作用，是抗擊囊膜病毒疾病的一種天生固有的免疫方式。BST2有如此廣譜的抑制病毒作用的原因之一，在于這些病毒都具有源于宿主細胞雙層脂膜的囊膜結(jié)構(gòu)，BST2能夠通過在病毒出細胞膜時直接拴住病毒而起到抑制作用，而近期研究發(fā)現(xiàn)，BST2還具有促進某些病毒進入細胞的功能。隨著對BST2功能和結(jié)構(gòu)的不斷了解，必將在相關(guān)藥物開發(fā)及疾病控制中發(fā)揮更大的作用。 本實驗利用分子生物學(xué)手段，通過軟件預(yù)測，根據(jù)已知的BST2基因序列設(shè)計出特異性引物，通過PCR技術(shù)擴增得到BST2的基因片段，經(jīng)過瓊脂糖電泳及測序證明我們正確擴增到BST2339bp的基因片段。設(shè)計了擴增質(zhì)粒和表達質(zhì)粒，將BST2基因片段克隆至質(zhì)粒中，質(zhì)粒鑒定正確后，轉(zhuǎn)化至BL21a大腸桿菌表達系統(tǒng)，可溶性表達了BST2的蛋白。鎳離子親和層與凝膠層析純化蛋白后，測定了蛋白濃度，使抗原達到免疫實驗要求。三次免疫Balb/C小鼠，加強免疫后采小鼠脾細胞與復(fù)蘇的SP2/0細胞株進行融合。經(jīng)過三個克隆階段，成功制備了2株鼠源單克隆抗體(McAb)，命名為10-1和11-1。經(jīng)測定效價均為107，Westernblot方法及表面等離子共振技術(shù)對其特異性及親和力等特性進行了檢測，結(jié)果顯示這兩株單抗具有較好的特異性和較高的親和力。采集并分離了HIV感染病人及正常人的外周血，并分離得到了外周血單核細胞(PBMCs)。通過流式細胞技術(shù)，利用單克隆抗體及綠色熒光FITC標(biāo)記的二抗共染了外周血單核細胞，比較了BST2蛋白在HIV感染病人與正常人外周血單核細胞中的表達差異。初步結(jié)果顯示，感染后人外周血單核細胞表面BST2表達量比正常人血液中的低。 BST2蛋白表達、單克隆抗體制備及檢測方法的初步應(yīng)用，，為進一步揭示BST2蛋白作用機制、功能及抗病毒藥物開發(fā)提供詳實數(shù)據(jù)及方法。
【圖文】：

人造BST2圖示

抑制最簡單的模型是 BST2 直接拴住完全成熟的已經(jīng)芽出的病毒（圖 ]。這種模型為免疫電鏡得出的數(shù)據(jù)支持，在 HIV 芽出的位點有 BS并且還有 BST2 被完全包進了病毒粒子[29]。BST2 全長 181 個氨基酸, 是一個大約 30-36KD 的小分子蛋白（糖基化，大小有所差異），屬于二類跨膜蛋白。BST2 單體由一個 N 端的跨膜段胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)、C 端的 GPI 錨定位點組成（圖 1-1）[5]；目前為止2 拓撲結(jié)構(gòu)相似的只有 PrP[6]。成熟的 BST2 在其多肽鏈的第 65 個和第酰胺處被糖基化，并能通過二硫鍵形成同源二聚體。該蛋白被定位在細一些具有膜結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)細胞器上，如 TGN 以及循環(huán)胞內(nèi)體[5,7-9]。BST2重要的特點。雖然它的胞內(nèi)區(qū)很短，但是卻意義重大。該胞內(nèi)區(qū)含有 基序，可以與網(wǎng)絡(luò)蛋白受體 AP-2 和 AP1 結(jié)合，直接進入胞吞作ear endosomes 胞內(nèi)區(qū)也間接與細胞的皮層肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)作用，但是這種與 BST2 作為一個抑制因子是否有關(guān)系仍舊未知[10]。靈長類動物的 BS的賴氨酸殘基，能被 KSHV 的 K5 蛋白識別并泛素化[11]。
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉豐亮;曹光;鄭永唐;;HIV-1限制因子及其基因多態(tài)性[J];生命的化學(xué);2010年05期

2 肖占沛;郭宏雄;羊海濤;;束縛蛋白抗HIV機制[J];生命的化學(xué);2011年04期

本文編號：2583860