【摘要】：目前大量文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)證實(shí)了nNOS來源的NO是正常成年腦組織中神經(jīng)發(fā)生的負(fù)調(diào)控因子，我們通過體外實(shí)驗(yàn)證明神經(jīng)元中nNOS產(chǎn)生的NO負(fù)調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化，這與整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。另一方面，我們觀察到抑制干細(xì)胞自身nNOS的活性明顯降低其增殖速率以及分化形成神經(jīng)元的比例,同時(shí)誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，這說明干細(xì)胞的nNOS有利于神經(jīng)發(fā)生。但是神經(jīng)干細(xì)胞核內(nèi)的nNOS是否是干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的必需分子，以及這是否與神經(jīng)元的存活相關(guān)，有待于我們進(jìn)一步的研究。 神經(jīng)干細(xì)胞分化與細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)，我們知道組蛋白脫乙�；福℉DAC）降低組蛋白乙�；潭�，使得染色體結(jié)構(gòu)緊縮，結(jié)果抑制基因表達(dá)。HDAC的亞型中HDAC1和HDAC2與神經(jīng)干細(xì)胞分化的關(guān)系最為緊密，但是在我們所關(guān)注的神經(jīng)元中HDAC1的表達(dá)幾乎不能被檢測(cè)到，所以我們重點(diǎn)觀察HDAC2對(duì)神經(jīng)元分化的影響，以及抑制干細(xì)胞中nNOS是否是通過HDAC2調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生的。 因此，我們?cè)谘芯恐兄饕接懴旅鎯蓚�(gè)問題：（1）神經(jīng)干細(xì)胞的nNOS是否是神經(jīng)元分化的必需分子；（2）神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)的nNOS是否是通過HDAC2調(diào)節(jié)自身增殖以及神經(jīng)元分化的。 第一章神經(jīng)干細(xì)胞nNOS是神經(jīng)元分化的必需分子 為了研究神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)的nNOS在其分化過程中是否扮演了非常重要的角色，我們進(jìn)行了如下的體外實(shí)驗(yàn)。首先，我們體外培養(yǎng)野生型（nNOS+/+）和nNOS基因敲除型（nNOS-/-）的胚胎小鼠神經(jīng)干細(xì)胞，讓其貼壁分化四天。從免疫熒光的結(jié)果中我們觀察到，雖然nNOS-/-后GFAP+星型膠質(zhì)細(xì)胞比例與nNOS+/+相比沒有差異，但是β-Ⅲ-Tubulin+神經(jīng)元的分化比例卻明顯下降（nNOS+/+20.39±1.20%，nNOS-/-11.21±2.69%）。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明敲除神經(jīng)干細(xì)胞nNOS抑制神經(jīng)元分化。 我們之前的研究結(jié)果證明了神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)的nNOS-/-后其自身的增殖能力顯著減弱，而神經(jīng)元分化比例的下降可能是三個(gè)方面的因素：減少神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)神經(jīng)元的死亡以及抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的趨勢(shì)。為了觀察敲除nNOS后神經(jīng)元分化比例的下降是其中某個(gè)因素的作用還是幾個(gè)因素的共同結(jié)果，我們采用nNOS特異性抑制劑L-VNIO(100μM)在分化后兩天給藥（即分化的第三天和第四天）。這種情況下，神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖沒有受到L-VNIO的明顯抑制，但我們可以觀察到在β-Ⅲ-Tubulin+神經(jīng)元比例下降的同時(shí)(Control20.83±0.31%，L-VNIO6.23±0.40%），L-VNIO也使得碘化丙啶陽性（PI+）的死亡細(xì)胞數(shù)顯著增多（Control3.48±0.07%，L-VNIO4.91±0.15%）。我們假設(shè)死亡的細(xì)胞全是神經(jīng)元，即L-VNIO顯著誘導(dǎo)了神經(jīng)元的凋亡，如果彌補(bǔ)上凋亡在神經(jīng)元分化比例方面的負(fù)面效應(yīng)后，L-VNIO仍然降低神經(jīng)干細(xì)胞分化形成神經(jīng)元的速率，那么我們就可以肯定L-VNIO抑制了神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的趨勢(shì)，即抑制神經(jīng)干細(xì)胞的nNOS活性阻礙了神經(jīng)元的分化命運(yùn)。我們采用了如下的公式：n_(j+1)=n_j+β_j(N_j-n_j)-δ_jnn_j；PI+_j+1-PI+_j=δ_jN_j，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)δ_jnn_j=δ_jN_j時(shí)，即假設(shè)PI+凋亡細(xì)胞都是神經(jīng)元，此時(shí)L-VNIO組的β_j(_j=4)值仍然顯著小于生理對(duì)照組（Control0.426±0.05，L-VNIO0.136±0.06）。以上結(jié)果說明，抑制nNOS負(fù)調(diào)控神經(jīng)元的分化命運(yùn)。 為了通過不同的干預(yù)手段來研究神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)的nNOS對(duì)神經(jīng)元分化的作用，我們?cè)谏窠?jīng)干細(xì)胞貼壁分化第一天給予50mM的KCl24小時(shí)，以增加神經(jīng)前體細(xì)胞中nNOS的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，KCl使得神經(jīng)元分化比例升高（Control14.07±1.03%，KCl24.95±2.07%），而且敲除nNOS后KCl的這種效應(yīng)被取消，說明KCl通過增加nNOS的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。同時(shí)我們還觀察到KCl會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，從而引起總細(xì)胞數(shù)的下降，為了排除KCl升高神經(jīng)元分化比例不是總細(xì)胞數(shù)下降導(dǎo)致的表面現(xiàn)象，我們將分化的神經(jīng)元的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示KCl給藥組的神經(jīng)元數(shù)也明顯多于對(duì)照組（Control15.65±1.08，KCl23.87±2.70）。上述實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)nNOS表達(dá)水平有利于神經(jīng)元的分化。 第二章nNOS通過HDAC2調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖和神經(jīng)元分化 之前，我們證實(shí)了神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)的nNOS是維持其自身增殖和神經(jīng)元分化的必需分子，并且據(jù)文獻(xiàn)推測(cè)組蛋白脫乙�；�2（HDAC2）很可能是這條通路中的關(guān)鍵分子。為了研究這一假說，我們首先觀察nNOS是否能調(diào)節(jié)HDAC2。我們體外培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，在神經(jīng)球狀態(tài)下給予100μM的nNOS特異性抑制劑L-VNIO，24h后提蛋白，Western Blot結(jié)果顯示，L-VNIO顯著抑制HDAC2的表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)nNOS對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞中HDAC2的調(diào)節(jié)作用，我們繼而采用nNOS基因敲除鼠培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型比較，nNOS敲除后HDAC2的表達(dá)下降，這與使用nNOS抑制劑L-VNIO的結(jié)果一致。我們給予神經(jīng)球100μM L-VNIO，作用3h后提蛋白并進(jìn)行免疫沉淀分離出HDAC2，再利用HDAC熒光測(cè)定試劑盒檢測(cè)其活性，結(jié)果表明L-VNIO不影響神經(jīng)干細(xì)胞中HDAC2的活性。另外，為了觀察在神經(jīng)干細(xì)胞分化階段nNOS如何影響HDAC2，我們?cè)谏窠?jīng)干細(xì)胞貼壁分化第二天給100μM的L-VNIO，48h后提蛋白，Western Blot測(cè)定結(jié)果表明，L-VNIO不顯著影響分化過程中HDAC2的表達(dá)，而在分化第四天給予L-VNIO3h卻可以增強(qiáng)HDAC2活性。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制神經(jīng)干細(xì)胞nNOS下調(diào)HDAC2的表達(dá)不影響其活性，而抑制分化細(xì)胞nNOS不影響HDAC2的表達(dá)卻顯著增強(qiáng)其活性。 既然nNOS可以影響HDAC2，那么nNOS是否是通過HDAC2調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖和神經(jīng)元分化的呢？針對(duì)這個(gè)問題，我們首先觀察HDAC2在干細(xì)胞增殖和分化過程中到底扮演了什么角色。一方面，我們使用HDAC2shRNA慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液，四天后將神經(jīng)球吹散計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染Control shRNA慢病毒顆粒組比較，HDAC2被干擾后干細(xì)胞的增殖能力受到抑制。另外，我們將轉(zhuǎn)染過HDAC2shRNA慢病毒的干細(xì)胞的單細(xì)胞懸液以2×104個(gè)/cm~2的密度接種到PORN/LAM包被的玻片上，讓其貼壁生長(zhǎng)，24h后摻入10μM的BrdU2h，BrdU免疫熒光結(jié)果同樣證實(shí)了干擾干細(xì)胞中HDAC2的表達(dá)會(huì)抑制其自身的增殖（LV-Control shRNA41.67±1.44%, LV-HDAC2shRNA33.27±1.74%）。我們讓轉(zhuǎn)染過HDAC2shRNA慢病毒顆粒的干細(xì)胞貼壁分化4天后，進(jìn)行β-Ⅲ-Tubulin免疫熒光實(shí)驗(yàn)，，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組的6.94±0.94%相比，HDAC2干擾后的神經(jīng)元比例上升到13.12±1.00%，說明HDAC2負(fù)調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化。另一方面，我們使用HDAC2過表達(dá)的腺相關(guān)病毒顆粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)和免疫熒光結(jié)果顯示過表達(dá)HDAC2對(duì)干細(xì)胞增殖沒有顯著影響，卻明顯抑制神經(jīng)元的分化比例。上述實(shí)驗(yàn)說明HDAC2是維持神經(jīng)干細(xì)胞增殖的必需分子，是神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的負(fù)調(diào)控因子。 最后，我們觀察胚胎和成年神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)的nNOS是否是通過HDAC2調(diào)節(jié)自身的增殖以及神經(jīng)元分化的。我們首先通過細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法觀察HDAC2過表達(dá)是否能逆轉(zhuǎn)L-VNIO引起的神經(jīng)干細(xì)胞增殖減慢的效應(yīng)。其次，我們通過免疫熒光方法觀察干擾掉HDAC2是否能逆轉(zhuǎn)L-VNIO抑制神經(jīng)元分化的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制nNOS分別通過下調(diào)神經(jīng)球狀態(tài)下HDAC2的表達(dá)和增強(qiáng)分化過程中HDAC2的活性減少神經(jīng)干細(xì)胞增殖和神經(jīng)元分化。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2582175