發(fā)布時間：2020-02-13 09:10

【摘要】：河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX)是毒性最強的非蛋白類神經毒素之一,分布廣泛,因最早從河豚魚體內分離而得名。在眾多河豚毒素的檢測技術中,免疫檢測技術因其靈敏度高和操作簡便等優(yōu)點受到人們的青睞,而免疫學檢測的關鍵要素是目標物質的特異性抗體。本研究首先以牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumi,OVA)、匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)為載體蛋白,分別與TTX進行偶聯(lián)以制備人工完全抗原。采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及紫外分光光度分析方法,優(yōu)化了河豚毒素人工完全抗原(BSA TTX)的合成條件,并篩選出較佳的反應條件,即反應時間為72h、偶聯(lián)劑添加量為12%、TTX與BSA質量比為1:5時河豚毒素免疫抗原偶聯(lián)率較大。同時應用聚丙烯酰胺凝膠電泳、紫外分光光度法、紅外光譜檢測技術以及Quantity One凝膠分析軟件計算偶聯(lián)率等方法建立了人工完全抗原的表征體系。然后利用制備出的兩種免疫抗原OVA TTX和KLH TTX免疫Balb/C小鼠,通過雜交瘤技術成功制備出兩株雜交瘤細胞OVA 1E3和KLH CB2。兩株細胞分泌的單克隆抗體均為IgM型,對兩種單克隆抗體的特異性鑒定結果顯示兩種單抗均與TTX有特異性結合。此外,本研究還針對不同載體蛋白對單克隆抗體制備產生的影響機理進行了初步探討。以疏水相互作用理論為基礎,結合不同蛋白的疏水性能,推理認為KLH是一種較適合于TTX特異性單抗制備的載體蛋白。本課題的研究為河豚毒素的免疫學分析檢測奠定了物質基礎,對推動河豚毒素免疫學檢測技術的發(fā)展具有重要意義。
【圖文】：

簡介 etrodotoxin，TTX）是毒性最強的非蛋白類神經毒素之一，存蜥蜴、青蛙、蟾蜍、扁形蟲等動物體內，某些細菌（如弧菌豚毒素[14]，因最早由日本學者田原良純1909年從河豚魚中發(fā)易潮解的白色結晶體，分子式 C11 H17N3O8 ，相對分子質量由 3 個氮原子組成，它們與氫氧原子形成特殊的結構。其結構 個胍基, 6 個羥基，在 C 5 和 C 10 位有一個半醛糖內酯連接色粉末，純品為無色晶體，，呈針狀或菱形，無臭，無味，易醚、苯等有機溶劑，微溶于水，極易溶于稀酸水溶液。 比較穩(wěn)定，在中性和酸性條件下對熱穩(wěn)定，240℃開始碳化，溶液中易分解，在 5%氫氧化鉀溶液中于 80℃~100℃可分解基 喹唑啉，這也是 TTX 化學檢測法的理論基礎[11, 13]。

Lane1. BSA +12%FALane3. BSA+ 6%FA;圖2 3.B。由圖差，反應條件量的偶聯(lián)體系加量的反應條%的甲醛添加作為最適的偶 g. 2 3 CharacX 與 BSA 質蛋白 BSA 和偶圖所示，TTXA=1:5 時條帶圖 2 4 TTXSpectrum of 3 非變性聚丙烯酰胺A; Lane2.TTX BSA+; Lane4. TTX BSA+3.A 可知，TT件為占總體積系，其偶聯(lián)物條件下，隨著反加量對載體蛋偶聯(lián)劑添加量 圖 2 3 不同cterization cha質量比的確定偶聯(lián)物在不同X BSA 凝膠條帶高度差異最X 與 BSA 不同non denaturimass 4 5 胺凝膠電泳圖譜+12%FA; 6%FA; 16 X BSA 凝膠條積 12%的甲醛物的分子量變反應時間的延蛋白沒有破壞。 同偶聯(lián)劑添加arts of the di定 同質量比反應條帶的位置均最大，即偶聯(lián)同質量比非變ing polyacrylaratio of TTX t000011bAorbsnaec 條帶的位置略醛添加量時條變化較為明顯延長，載體蛋壞性的變性作 B. 12%偶聯(lián)加量的表征圖fferent amou應條件下的非均略高于對照聯(lián)物的分子量 變性聚丙烯酰amide gel eleto BSA 00.20.40.60.811.21.4220 230略高于對照的條帶高度差較顯；此外
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：2579080