【摘要】：基于本課題前期關(guān)于以PSCA(Prostate stem cell antigen, PSCA)為靶點的前列腺癌治療性DNA疫苗的研究結(jié)果,本研究擬選取人源的熱休克蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)作為佐劑分子,構(gòu)建用于前列腺癌治療用的重組亞單位疫苗及重組腺病毒載體疫苗,期望能夠利用HSP70分子的佐劑功能和分子伴侶功能增強PSCA蛋白的可溶性和免疫后機體的免疫水平;同時基于“prime-boost”免疫策略的考慮,希望不同疫苗的聯(lián)合免疫能夠明顯提高機體的免疫水平。通過在小鼠前列腺癌模型上系統(tǒng)地檢測不同疫苗的免疫水平,評價以PSCA作為治療靶點的疫苗的免疫效果,為前列腺腫瘤疫苗的研制及臨床研究奠定基礎(chǔ)。 為構(gòu)建重組亞單位疫苗,通過對PSCA進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,保留其活性結(jié)構(gòu)域的部分,然后將PSCA、HSP70基因分別克隆至原核表達(dá)載體pET21a(+)質(zhì)粒中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET21-PSCA-HSP。SDS-PAGE電泳分析表明PSCA-HSP在E.coli中得到可溶性表達(dá)。為了評價重組亞單位疫苗的免疫效果,在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)了PSCA、HSP70及PSCA-HSP重組蛋白,并經(jīng)過色譜層析技術(shù)獲得了具有一定純度的重組蛋白。免疫C57BL/6雄性小鼠后,通過上述技術(shù)方法檢測了針對PSCA的細(xì)胞免疫和體液免疫水平,并觀察小鼠的腫瘤生長情況及死亡時間。研究結(jié)果表明,免疫重組蛋白PSCA-HSP能夠激起PSCA特異的細(xì)胞免疫反應(yīng);PSCA、PSCA+HSP及PSCA-HSP免疫組均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較高的針對PSCA的抗體,三組之間的抗PSCA抗體水平?jīng)]有差異;HSP、PSCA+HSP及PSCA-HSP免疫組均誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了較高水平的針對HSP的抗體,三組之間的抗體水平?jīng)]有差異;免疫PSCA、PSCA+HSP及PSCA-HSP均能抑制小鼠腫瘤的生長,延長荷瘤小鼠的存活時間,其中PSCA-HSP的抗腫瘤效果要優(yōu)于其它兩組。 為構(gòu)建重組腺病毒載體疫苗,將PSCA基因從實驗室保存的質(zhì)粒pcDNA-PSCA中酶切獲得,將PSCA-HSP融合基因從實驗室保存的質(zhì)粒pcDNA-PSCA-HSP中酶切獲得,分別克隆至pDC316質(zhì)粒中,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pDC316-PSCA及pDC316-PSCA-HSP,將重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行腺病毒包裝,制備重組腺病毒Ad5-PSCA及Ad5-PSCA-HSP。為了評價重組腺病毒載體疫苗的免疫效果,免疫C57BL/6雄性小鼠后,通過ELISPOT、胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測和ELISA等手段檢測了針對PSCA的細(xì)胞免疫和體液免疫水平,并觀察小鼠的腫瘤生長情況及死亡時間。研究結(jié)果表明,免疫Ad5-PSCA及Ad5-PSCA-HSP均能夠激起機體強烈的PSCA特異的細(xì)胞免疫反應(yīng),但是各組針對PSCA的抗體效價水平均較低;免疫Ad5-PSCA及Ad5-PSCA-HSP均能抑制小鼠腫瘤的生長,延長荷瘤小鼠的存活時間,其中Ad5-PSCA-HSP的抗腫瘤效果要優(yōu)于Ad5-PSCA。 基于“prime-boost”免疫策略,本研究將以PSCA為靶點的重組腺病毒載體疫苗以及重組亞單位疫苗聯(lián)合免疫C57BL/6雄性小鼠,通過上述各項免疫指標(biāo)的檢測比較不同疫苗的細(xì)胞及體液免疫水平,并觀察小鼠的腫瘤生長情況及死亡時間。研究結(jié)果表明,各免疫組均能激起PSCA特異的細(xì)胞及體液免疫反應(yīng);各免疫組均能抑制小鼠腫瘤的生長,延長荷瘤小鼠的存活時間,其中Ad5-PSCA-HSP+PSCA-HSP混合免疫方式獲得了最佳的抗腫瘤效果。 本研究構(gòu)建了基于PSCA為靶點的重組腺病毒載體疫苗及重組亞單位疫苗,并在小鼠前列腺腫瘤模型上評價了不同疫苗的免疫效果,為前列腺腫瘤疫苗的研制及臨床研究奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

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