【摘要】：導(dǎo)致椎間盤退變的因素很多,而椎間盤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)減少是其中的因素之一。椎間盤是人體最大的無(wú)血管組織,營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)相對(duì)缺乏。椎間盤營(yíng)養(yǎng)通過(guò)軟骨終板和纖維環(huán)這兩條途徑擴(kuò)散入椎間盤內(nèi),而椎間盤內(nèi)髓核細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)主要通過(guò)終板途徑獲得營(yíng)養(yǎng)。隨著年齡逐漸增加,軟骨終板逐漸變薄、鈣化,軟骨終板的血管數(shù)量也就逐漸減少。髓核細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)相對(duì)缺乏,從而導(dǎo)致髓核細(xì)胞數(shù)量減少,最終導(dǎo)致椎間盤退變。葡萄糖是椎間盤髓核細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)成分之一,葡萄糖是通過(guò)糖酵解的方式向椎間盤提供能量的,故椎間盤需要消耗大量的葡萄糖。在椎間盤軟骨終板鈣化的情況下,軟骨終板限制了葡萄糖的通過(guò),導(dǎo)致椎間盤髓核內(nèi)葡萄糖濃度降低,進(jìn)而導(dǎo)致髓核細(xì)胞活性降低和凋亡增加。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹荚谘芯康蜐舛绕咸烟菍?duì)體外培養(yǎng)髓核細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)及凋亡的影響,為椎間盤退變的病因?qū)W研究提供依據(jù)。 一、人椎間盤髓核細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 人髓核組織取自脊柱側(cè)彎矯形手術(shù)患者,年齡在10-15歲,術(shù)前MRI檢查證實(shí)椎間盤信號(hào)與正常椎間盤信號(hào)一致。所取標(biāo)本在超凈臺(tái)上仔細(xì)分離出韌帶、纖維環(huán)和軟骨終板,剪碎髓核組織。0.25%的胰蛋白酶消化約40min。0.2%Ⅰ型膠原酶和0.2%Ⅱ型膠原酶混勻消化約3h,待髓核組織變成絮狀物質(zhì)后,用DF12+ 10%FBS終止消化。離心,去除組織殘?jiān)?加入DF12 +15%FBS培養(yǎng)液。細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài);GAG和Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定細(xì)胞表型。結(jié)果:GAG染色和Ⅱ型膠原染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定所得細(xì)胞為髓核細(xì)胞,甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài)正常,MTT法繪制生長(zhǎng)曲線顯示細(xì)胞生長(zhǎng)良好。結(jié)論:胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶混合培養(yǎng)法所得髓核細(xì)胞形態(tài)正常,細(xì)胞生長(zhǎng)良好,表型表達(dá)為髓核細(xì)胞,滿足椎間盤體外實(shí)驗(yàn)研究。 二、不同葡萄糖濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)體外培養(yǎng)椎間盤髓核細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)和凋亡的作用 實(shí)驗(yàn)中的髓核細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)一中培養(yǎng)的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為四組:加入葡萄糖濃度為5mmol/L的培養(yǎng)液組(對(duì)照組);加入葡萄糖濃度為2.5mmol/L的培養(yǎng)液組;加入葡萄糖濃度為1mmol/L的培養(yǎng)液組;加入葡萄糖濃度為0mmol/L的培養(yǎng)液組。MTT法繪制生長(zhǎng)曲線;培養(yǎng)48h和72h后,相差顯微鏡觀察髓核細(xì)胞形態(tài)變化;透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果可以看到,隨著培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的不斷降低,細(xì)胞數(shù)量也逐漸減少。這說(shuō)明過(guò)低的葡萄糖濃度細(xì)胞培養(yǎng)液可抑制髓核細(xì)胞的增殖。對(duì)照組中,細(xì)胞呈多角形或短梭形。超微結(jié)構(gòu)顯示,細(xì)胞核為橢圓形,核膜完整,有1-3個(gè)大小不等的核仁。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張,線粒體結(jié)構(gòu)正常。在2.5mmol/L組、1mmol/L組、0mmol/L組中,倒置顯微鏡下均可見(jiàn)到大量的長(zhǎng)梭形細(xì)胞,胞質(zhì)減少,折光性減弱等細(xì)胞衰老跡象。2.5mmol/L組、1mmol/L組中,透射電鏡可觀察到髓核細(xì)胞內(nèi)大量溶酶體和脂肪滴,濃縮的核染色質(zhì)邊聚。0mmol/L中,透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化為,胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目明顯減少,細(xì)胞器破壞,胞膜不完整,部分細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)到空泡及吞噬現(xiàn)象。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,隨著葡萄糖濃度的降低,細(xì)胞凋亡率逐漸增高。結(jié)論:隨著葡萄糖濃度的降低,人椎間盤髓核細(xì)胞的增殖被抑制,細(xì)胞凋亡率增加,細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生改變。 營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)是椎間盤退變的重要因素之一,沒(méi)有充足的葡萄糖供應(yīng),椎間盤髓核細(xì)胞不能長(zhǎng)時(shí)間存活。髓核細(xì)胞活性和功能的維持有賴于糖酵解過(guò)程產(chǎn)生的能量。糖濃度降低導(dǎo)致細(xì)胞能量供應(yīng)減少,細(xì)胞活性降低,凋亡增加等一系列細(xì)胞功能改變。
【圖文】：

原代未貼壁髓核細(xì)胞（×100）圖 2 部分貼壁的髓核細(xì)胞（×100）

Fig 3 Nucleus pulposus cells by toluidineblue staining（×100）Fig 4 Nucleus pulposus cells by toluidineblue staining（×200）3.2 髓核細(xì)胞表型鑒定細(xì)胞質(zhì)染色為磚紅色，細(xì)胞核深染。糖胺聚糖染色髓核細(xì)胞呈陽(yáng)性，，說(shuō)明細(xì)胞外基質(zhì)中含有糖胺聚糖(圖 5)。Ⅱ型膠原免疫組化染色細(xì)胞漿為棕
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 郭健行;黃桂成;;椎間盤退變影響因素研究進(jìn)展[J];國(guó)際骨科學(xué)雜志;2008年01期

本文編號(hào)：2573797