【摘要】：維甲酸相關(guān)孤核受體a (retinoid acid receptor related orphan receptor, RORα, NR1F1)是一種屬于類固醇激素受體超家族成員的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,它能夠直接進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而參與多種重要生理過程的調(diào)節(jié),在形態(tài)發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持、生物代謝調(diào)控、高級神經(jīng)功能控制以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)RORa基因缺陷的模型小鼠體內(nèi)出現(xiàn)了廣泛而嚴(yán)重的功能性障礙,尤其是容易罹患自身免疫性疾病和過敏性疾病,并表現(xiàn)出明顯的免疫功能異常,如T細(xì)胞和B細(xì)胞功能缺陷、巨噬細(xì)胞釋放致炎因子(如IL-1、IL-6、TNF-α)增多等�？梢酝茢郣ORα與免疫系統(tǒng)的關(guān)系非常密切,其抗炎作用在多種疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯恐幸训玫阶C實(shí)。 α-黑素細(xì)胞刺激素(alpha-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)是一種內(nèi)源性小分子神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)肽,它不僅能促進(jìn)黑色素形成使皮膚變黑,而且具有明確的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。α-MSH通過黑皮質(zhì)素受體(melanocortin receptor, MCR)的介導(dǎo)發(fā)揮多種生理功能,這些受體廣泛表達(dá)于各種組織,包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周組織及免疫細(xì)胞。目前已知的MCR共有5種亞型(MC1R～MC5R),除MC2R以外,其他受體均能結(jié)合α-MSH,其中MC1R和MC5R主要介導(dǎo)其抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。理論上,α-MSH作為天然的抗炎免疫調(diào)節(jié)劑可以用于自身免疫病、過敏性疾病的防治以及避免移植排斥反應(yīng),但由于其結(jié)合受體的選擇性低,生物學(xué)作用不僅限于免疫調(diào)節(jié),還能同時影響機(jī)體其他神經(jīng)內(nèi)分泌功能,導(dǎo)致皮膚變黑等,限制了α-MSH的實(shí)際應(yīng)用。因此基于天然α-MSH結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和不同MCR亞型介導(dǎo)的效應(yīng),設(shè)計合成新的類似物將更具有應(yīng)用于臨床的前景。本實(shí)驗(yàn)室自主研制了α-MSH的新型類似物(專利授權(quán)號ZL200510026927.3,命名為STY39),是一種對MC1R與MC5R均具有高選擇性的激動劑。經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)已證明,STY39對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克小鼠和博萊霉素誘導(dǎo)的急性肺部炎癥和肺纖維化大鼠具有很好的保護(hù)作用,能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)組織因子而上調(diào)組織因子途徑抑制因子的表達(dá),還能顯著下調(diào)晚期炎癥因子高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的表達(dá)以有助于控制炎癥發(fā)展。 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,承接固有免疫和適應(yīng)性免疫,是啟動、調(diào)控和維持適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。DCs的功能與其成熟狀態(tài)密切相關(guān)：成熟DCs能有效激活免疫應(yīng)答,在抗腫瘤、抗感染免疫方面意義重大；而非成熟DCs具有致免疫耐受性,在防治移植排斥和自身免疫病方面具有重要意義。本課題組在探究α-MSH對DCs分化成熟的調(diào)控作用中,己明確α-MSH可以抑制人外周血單核細(xì)胞來源DCs的發(fā)育成熟,且提示可能與RORα蛋白表達(dá)增高相關(guān)。聯(lián)系己知關(guān)于RORα在抗炎過程中發(fā)揮的確切效應(yīng)以及在細(xì)胞增殖分化中的作用,我們推測RORα亦可能參與DCs分化成熟的調(diào)控過程。因此本課題將深入研究RORα是否與DCs的分化發(fā)育有關(guān),RORα在α-MSH調(diào)控DCs分化成熟中的作用與機(jī)制,迄今為止尚未見類似報道。本課題研究內(nèi)容共分為以下四個部分。 第一部分α-MSH及其類似物STY39對DCs表達(dá)RORα的影響 目的：探明不同濃度α-MSH或其類似物STY39作用與RORα表達(dá)量之間的關(guān)系。方法：利用體外分離培養(yǎng)的小鼠骨髓來源DCs作為研究對象,用50 ng/ml TNF-α刺激DCs(TNF-α-DCs),誘導(dǎo)DCs成熟,再分別以不同濃度α-MSH或STY39(10-6 mol/L、10-8mol/L、10-10mol/L和10-12mol/L)處理。然后于作用不同時間點(diǎn),通過Western blotting法和實(shí)時熒光定量RT-PCR法檢測RORα的蛋白和基因表達(dá)水平。結(jié)果：TNF-α-DCs中RORα蛋白和mRNA表達(dá)較對照組降低,在α-MSH (10-8、10-10 mol/L)或STY39(10-10 mol/L)作用后,RORα蛋白和mRNA的表達(dá)量均明顯增加(P0.05)。結(jié)論：α-MSH或STY39可以上調(diào)TNF-a刺激的小鼠骨髓來源DCs中RORα的表達(dá)。 第二部分高表達(dá)RORα對TNF-α誘導(dǎo)DCs成熟的影響 目的：觀察RORα在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)是否影響DCs的發(fā)育成熟。方法：首先構(gòu)建rAAV-RORα-hrGFP重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染TNF-α-DCs,獲得高表達(dá)RORα的DCs(rAAV-RORα-hrGFP-TNF-α-DCs),然后觀察其表型變化和功能狀態(tài)。用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測DCs表型(Iab、CD86、CD54)；采用FITC-BSA吞噬實(shí)驗(yàn)并經(jīng)FCM分析DCs吞噬抗原功能的變化；以3H-TdR摻入法測定DCs刺激抗原特異性T細(xì)胞增殖的能力；ELISA檢測DCs產(chǎn)生IL-6、IL-12、IL-10的水平。結(jié)果：與rAAV-IRES-hrGFP-TNF-α-DCs(空載體對照)相比,rAAV-RORα-hrGFP-TNF-α-DCs呈現(xiàn)以下變化：①Iab、CD86、CD54分子的表達(dá)明顯下調(diào)；②吞噬FITC-BSA的功能增強(qiáng)(P0.05)；③刺激抗原特異性T細(xì)胞增殖的能力明顯減弱(P0.01)；④IL-6和IL-12的分泌減少(P0.05),而IL-10的分泌水平明顯上升(P0.01)。結(jié)論：使TNF-α刺激的DCs內(nèi)高表達(dá)RORα可以抑制DCs的發(fā)育成熟。 第三部分RORα在α-MSH及其類似物STY39抑制DCs成熟中的作用 目的：研究RORα在α-MSH或STY39抑制DCs成熟過程中的作用。方法：設(shè)計合成RORα的siRNAs,采用RNA干擾技術(shù)沉默TNF-α-DCs中RORαmRNA的表達(dá),觀察10-10mol/Lα-MSH或STY39作用后[即α-MSH (or STY39)-RORα-siRNA-TNF-α-DCs],是否改變其成熟狀態(tài)。測定指標(biāo)包括：DCs的表型(Iαb、CD86、CD54)、吞噬功能、刺激抗原特異性T細(xì)胞增殖的能力以及產(chǎn)生IL-6、IL-12、IL-10的水平,方法同第二部分。結(jié)果：與α-MSH(or STY39)-non-siRNA-TNF-α-DCs(非特異性干擾對照組)相比,α-MSH(or STY39)-ROR-siRNA-TNF-α-DCs發(fā)生如下改變：①Iαb\CD86、CD54分子的表達(dá)水平明顯增高；②吞噬BSA抗原的功能降低(P0.05)；③刺激抗原特異性T細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)(α-MSH, P0.05; STY39,P0.01)；④IL-6和IL-12的分泌水平升高(P0.05),而IL-10的分泌減少(α-MSH,P0.05；STY39,P0.01)。結(jié)論：α-MSH或STY39抑制TNF-α-DCs成熟可能部分地通過誘導(dǎo)RORα高表達(dá)介導(dǎo)。 第四部分RORα參與α-MSH及其類似物STY39抑制DCs成熟的機(jī)制 目的：探討RORα參與α-MSH及其類似物STY39抑制DCs成熟的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。方法：①將DCs分為：未成熟對照組(imDCs)、50 ng/ml TNF-α刺激組(TNF-α-DCs)、10-10 mol/Lα-MSH或STY39處理組[α-MSH(or STY39)+TNF-α-DCs]、rAAV-RORα-hrGFP-TNF-α-DCs組和rAAV-IRES-hrGFP-TNF-α-DCs(空載體對照)組,用實(shí)時熒光定量RT-PCR的方法檢測不同處理組α-MSH的天然受體(MC-1-5R)的表達(dá)情況；②利用各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性阻斷劑包括SB203580 (p38/MAPK)、GF10933X (PKC)、H89 (PKA)、PD98059 (ERK1/ERK2)和PDTC(NF-κB)等分別作用于經(jīng)10-10 mol/Lα-MSH或STY39+TNF-α處理的DCs,然后采用實(shí)時熒光定量RT-PCR方法檢測各組RORα的mRNA表達(dá)情況；③通過Western blot檢測TNF-α-DCs高表達(dá)RORα后細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65和IκBα蛋白的表達(dá)情況；④采用雙熒光素酶報告基因法檢測TNF-α-DCs高表達(dá)RORα后以及STY39+TNF-α-DCs的RORα被干擾表達(dá)后NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果：①M(fèi)C-1-5R可組成性表達(dá)于DCs, TNF-α作用后可上調(diào)MC1R和MC5R的表達(dá)量(P0.01)下調(diào)MC3R和MC4R的表達(dá)量(P0.05);②α-MSH和STY39均能上調(diào)TNF-α-DCs的MC1R表達(dá)(P0.05),STY39還能上調(diào)imDCs的MC5R表達(dá)(P0.05)；③細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)RORα可使imDCs和TNF-α-DCs表達(dá)MC1R增加(P0.05)；④經(jīng)α-MSH或STY39+TNF-α刺激的DCs,使用阻斷劑SB203580、GF10933X或H89作用后,RORαmRNA的表達(dá)量均明顯降低(P0.01)；⑤高表達(dá)RORα可顯著減少TNFα-DCs胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白含量、增加胞漿內(nèi)IκBα蛋白含量,同時抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性(P0.01)；干擾RORα表達(dá)的TNFα-DCs在STY39作用后,NF-κB轉(zhuǎn)錄活性明顯高于未干擾對照組(P0.05)。結(jié)論：在α-MSH或STY39抑制TNF-α誘導(dǎo)DCs成熟的過程中,可由MCR介導(dǎo)通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(p38/MAPK、PKC、PKA)上調(diào)RORα在TNF-α-DCs中的表達(dá)。高表達(dá)RORα一方面通過上調(diào)IKBα蛋白表達(dá)量、抑制NF-кB的轉(zhuǎn)核與轉(zhuǎn)錄活性,導(dǎo)致DCs的成熟信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻；另一方面可誘導(dǎo)MCR表達(dá)以進(jìn)一步增強(qiáng)起始信號,從而發(fā)揮抑制DCs分化成熟的作用。 綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn)RORα參與了DCs發(fā)育成熟的調(diào)控；在α-MSH或其類似物STY39抑制TNF-α誘導(dǎo)DCs成熟的過程中,RORα發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用；α-MSH或STY39可通過MCR介導(dǎo)下游多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如p38/MAPK、PKC、PKA等)使RORα的表達(dá)增加,并使TNF-α刺激的DCs表達(dá)MC-1R和MC-5R上調(diào)；高表達(dá)的RORα一方面增加MBα的表達(dá)量、抑制NF-κB的核移位和轉(zhuǎn)錄活性,另一方面又可促進(jìn)MCR的表達(dá)以進(jìn)一步增強(qiáng)起始信號,從而發(fā)揮抑制DCs分化成熟的作用。本研究有助于深入闡明α-MSH及其類似物STY39的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制,為探尋以DCs為基礎(chǔ)的防治自身免疫病、腫瘤、感染以及移植排斥反應(yīng)的新措施提供了新靶點(diǎn),并為探明神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在疾病發(fā)生與防治中的作用提出了新證據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 尹美珍;李世普;袁琳;戴紅蓮;;小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J];武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2006年02期

2 張莉;韓德平;張麗娟;田野蘋;;α-MSH基因轉(zhuǎn)染的小鼠同種異體移植心臟存活期延長[J];免疫學(xué)雜志;2008年05期

3 張麗娟;田野蘋;;α黑素細(xì)胞刺激素基因轉(zhuǎn)染對小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞成熟的影響[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2006年02期

4 陳家軍;孫宗全;董念國;蘇剛;劉超;劉金平;鄧勇志;;RNA干擾抑制MyD88表達(dá)對小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞生物學(xué)活性的影響[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2007年03期

5 梁政;羅榮城;尤長宣;鄭航;;rAAV-AFP轉(zhuǎn)染人外周血單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞增強(qiáng)免疫刺激功能[J];世界華人消化雜志;2006年14期

6 應(yīng)楹;田野蘋;張麗娟;韓德平;閔彥;;新型α-黑素細(xì)胞刺激素類似物對內(nèi)毒素休克小鼠的保護(hù)作用[J];中國新藥雜志;2006年18期

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本文編號：2571901