發(fā)布時間：2019-12-02 22:00

【摘要】：目的： 1.研究人血漿Exosomes小體的生物學特征,了解血漿Exosomes在免疫系統(tǒng)中的作用。 2.通過將人血漿Exosomes小體與體外誘導分化獲得的人MⅠ巨噬細胞共孵育,研究巨噬細胞的Wnt5a通路是否被血漿Exosomes小體激活。 方法： 1.采用超速離心和超濾的方法分離純化血漿外泌體樣小體,從而獲得無菌的血漿外泌體樣小體。用透射電鏡觀察血漿Exosomes形態(tài)；流式檢測血漿Exosomes分子表型；Western blot檢測血漿Exosomes的蛋白。 2.從健康人的外周血中分離PBMCs,然后體外培養(yǎng)誘導獲得Ⅰ型巨噬細胞。通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)及流式檢測細胞表面分子確定培養(yǎng)細胞是否為巨噬細胞。將血漿外泌體樣小體與Ⅰ型巨噬細胞混合培養(yǎng)后,提取巨噬細胞的RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄擴增及電泳比較未受血漿外泌體樣小體刺激的巨噬細胞及受刺激的巨噬細胞的炎性因子基因的變化,如：IL1β, IL6、TNFα、IL10。用流式檢測血漿外泌體樣小體處理巨噬細胞不同時間段胞內(nèi)Ca2+的變化,其中以Wnt5a刺激巨噬細胞胞內(nèi)Ca2+的變化做陽性對照組。用Western Blot方法檢測了血漿外泌體樣小體刺激的巨噬細胞CamKⅡ是否發(fā)生了磷酸化。 結(jié)果： 1.從健康人血漿中超速離心獲得Exosomes。用透射電鏡觀察小體形態(tài),這些小體形態(tài)均一,為圓形囊泡結(jié)構(gòu)；采用CD63抗體包被磁珠捕獲的血漿Exosomes樣小體的CD81的陽性率為73.68%,17.83%的血漿Exosomes樣小體表達CD86, HLA-DR陽性率為60.63%,血漿Exosomes樣小體還表達黏附相關(guān)的分子CD54和CDllc,陽性率分別為14.66%和17.83%；血漿Exosomes富含有CD63和CD81蛋白,而且通過實驗還發(fā)現(xiàn)小體含有HLA-DR、CD80、CD86和Wnt5a分子。 2.通過流式檢測發(fā)現(xiàn)Exosomes與巨噬細胞孵育一段時間后,巨噬細胞胞漿內(nèi)Ca2+平均熒光強度上調(diào)。RT-PCR檢測出Exosomes對巨噬細胞的促炎因子如IL1β、IL6、TNFα的表達有促進作用,在2h時,IL1β、TNFα基因表達達到高峰,分別比對照組上調(diào)表達0.85倍和1.69倍,而IL6基因上調(diào)表達的量在4h達到高峰,是對照組的3.7倍,而對抑炎因子IL10的表達具有抑制作用。RT-PCR也檢測出巨噬細胞表達Frizzled5受體,但是Exosomes對其基因的表達沒有影響。Western Blot檢測P-CamKⅡ蛋白發(fā)現(xiàn)Exosomes能使CamKⅡ發(fā)生磷酸化。 結(jié)論： 1.血漿中的小體在大小及形態(tài)上跟外泌體樣小體相似。這種小體也表達外泌體樣小體功能相關(guān)分子,如HLA-DR, CD80和CD86,且含有豐富的功能性蛋白,因此血漿外泌體樣小體可能由多種細胞分泌產(chǎn)生,而且在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。 2.初步研究發(fā)現(xiàn)血漿外泌體樣小體能上調(diào)巨噬細胞炎癥因子基因的表達,并且信號通路中的CaMKⅡ蛋白發(fā)生了磷酸化,因此可能通過活化巨噬細胞的Wnt5a- Ca2+信號通路促進炎性細胞因子的分泌。
【圖文】：

圖la圖lb圖1電鏡檢測血漿Exosomes小體形態(tài)二、流式檢測血漿ExosomeS分子表型CD63是ExosomeS的標志性蛋白，采用CD63抗體可捕獲血漿ExosomeS樣小體。流式檢測血漿ExosomeS高表達CD81為73.68%，17.83%的血漿Exosomes樣小體表達CD86，HLA一DR陽性率為60.63%，血漿ExosomeS樣小體還表達勃附相關(guān)的分子CD54和CDllc，這些分子可能顯示了血漿ExosomeS來自多種細胞。。況。胃。況。畏

復旦大學碩士學位論文、Westernblot檢測血漿ExosomeS的免疫相關(guān)蛋白為了研究血漿ExosomeS的生物學特性，，采用WeSteI’nblot方法對ExosomeS的蛋白做了進一步研究。結(jié)果顯示，人血漿Exosome:富含有CD63和CD81。而且通過實驗還發(fā)現(xiàn)小體含有HLA一DR，CD80和CD86，說明一些血漿Ex。SomeS可能來源于抗原提呈細胞，這些重要的免疫分子可能在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用。另外，我們還發(fā)現(xiàn)血漿Exosomes含有Wnt3a、Wntsa分子，為下一步研究血漿ExosomeS對巨噬細胞的作用提供了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

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