【摘要】：[目的]構建在心肌中特異性表達外源性核仁素的轉基因小鼠,研究核仁素在整體動物水平能否發(fā)揮心肌保護作用。[方法]①利用基因重組技術構建小鼠核仁素基因表達質粒(pcDNA3.1-Ncl),轉染至H9C2細胞后,采用RT-PCR和Western-blot方法檢測小鼠核仁素基因在真核細胞中的表達能力；②將具有表達能力的小鼠核仁素基因序列通過基因重組方法構建心肌特異表達外源性核仁素蛋白的表達質粒(Alpha-MyHc clone 26-Ncl),經(jīng)酶切、測序驗證其準確性；③制備心肌細胞內(nèi)特異性表達外源性核仁素的轉基因小鼠,采用PCR技術鑒定轉基因小鼠基因型。采用real-time PCR方法檢測轉基因小鼠心肌中核仁素基因的相對含量；采用Western-blot方法檢測轉基因小鼠心肌組織及其他組織中核仁素蛋白的表達。④采用組織切片及HE染色法觀察轉基因小鼠心肌組織形態(tài)；測量心臟重量、體重、心臟重量指數(shù)；測量左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt),觀察核仁素在心肌組織高表達后對小鼠心臟形態(tài)功能是否有影響。⑤應用轉基因小鼠制備心肌缺血-再灌注損傷模型,檢測心肌caspase-3活性、血清肌酸激酶活性和左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt)變化,研究核仁素對心肌缺血-再灌注損傷的影響。[結果]①成功構建核仁素真核表達質粒(pcDNA3.1-Ncl)和小鼠核仁素基因的心肌特異性表達載體(Alpha-MyHc clone 26-Ncl),制備了核仁素在心肌組織內(nèi)特異性高表達的轉基因小鼠。②轉基因小鼠心肌組織形態(tài)、心臟重量、體重、心臟重量指數(shù),以及正常時左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt)與野生型小鼠相比無明顯差異。③與野生型小鼠相比,核仁素轉基因小鼠心肌缺血-再灌注損傷后心肌caspase-3活性降低,血清肌酸激酶活性降低,左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt)升高。[結論]核仁素在整體動物水平能減輕心肌缺血-再灌注損傷。
【圖文】：

第三章結果仁素Alpha一M》·Hce一one26一Nc一質質粒(PcDNA3.1一Nd)的構建與鑒定coRI酶切位點的引物，，通過PCR方法從小鼠閱讀框架序列，插入載體質粒PcDNA3.1中，嚨coRI酶切鑒定。質粒酶切后電泳結果(帶，大小符合載體質粒長度與插入片段長度符合小鼠核仁素基因開放閱讀框架(圖2)。

核仁素基因mRNA水平及蛋白質水平的表達情況。結果顯示，與轉染空載體(PcDNA3.l)的細胞的相比，轉染小鼠核仁素表達質粒(peDNA3.1一Ncl)細胞中核仁素的n1RNA(圖3)和蛋白質(圖4)表達水平明顯增加。該結果提示PcDNA3.1一Ncl能在真核細胞中有效表達核仁素。刊 .1232000bP1000bP750b500bP核仁素250bP600bP500bPGAPDH圖3M:采用RT-PcR分析peDNA3.1一Ncl瞬時轉染HgcZ細胞后核仁素mRNA的表達情況 DNAMarker;1:正常HgcZ細胞;2:轉染空載體質粒peDNA3，1細胞;3:轉染PcDNA3.l一Nel細胞
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 鄒江;王慷慨;劉可;易宇欣;鄂順梅;張玲莉;肖獻忠;;核仁素反義寡核苷酸對RAW264.7細胞增殖與凋亡的影響[J];醫(yī)學臨床研究;2005年12期

相關博士學位論文 前2條

1 張彬;核仁素在大鼠缺血—再灌注損傷心肌中的表達及其抗心肌細胞凋亡作用研究[D];中南大學;2009年

2 蔣碧梅;核仁素在大鼠心肌缺血預適應中的作用及其機制研究[D];中南大學;2010年

本文編號：2566777