【摘要】：[目的]構(gòu)建在心肌中特異性表達(dá)外源性核仁素的轉(zhuǎn)基因小鼠,研究核仁素在整體動(dòng)物水平能否發(fā)揮心肌保護(hù)作用。[方法]①利用基因重組技術(shù)構(gòu)建小鼠核仁素基因表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-Ncl),轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后,采用RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)小鼠核仁素基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)能力；②將具有表達(dá)能力的小鼠核仁素基因序列通過基因重組方法構(gòu)建心肌特異表達(dá)外源性核仁素蛋白的表達(dá)質(zhì)粒(Alpha-MyHc clone 26-Ncl),經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證其準(zhǔn)確性；③制備心肌細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)外源性核仁素的轉(zhuǎn)基因小鼠,采用PCR技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型。采用real-time PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠心肌中核仁素基因的相對(duì)含量；采用Western-blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠心肌組織及其他組織中核仁素蛋白的表達(dá)。④采用組織切片及HE染色法觀察轉(zhuǎn)基因小鼠心肌組織形態(tài)；測(cè)量心臟重量、體重、心臟重量指數(shù)；測(cè)量左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt),觀察核仁素在心肌組織高表達(dá)后對(duì)小鼠心臟形態(tài)功能是否有影響。⑤應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠制備心肌缺血-再灌注損傷模型,檢測(cè)心肌caspase-3活性、血清肌酸激酶活性和左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt)變化,研究核仁素對(duì)心肌缺血-再灌注損傷的影響。[結(jié)果]①成功構(gòu)建核仁素真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-Ncl)和小鼠核仁素基因的心肌特異性表達(dá)載體(Alpha-MyHc clone 26-Ncl),制備了核仁素在心肌組織內(nèi)特異性高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠。②轉(zhuǎn)基因小鼠心肌組織形態(tài)、心臟重量、體重、心臟重量指數(shù),以及正常時(shí)左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt)與野生型小鼠相比無明顯差異。③與野生型小鼠相比,核仁素轉(zhuǎn)基因小鼠心肌缺血-再灌注損傷后心肌caspase-3活性降低,血清肌酸激酶活性降低,左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt)升高。[結(jié)論]核仁素在整體動(dòng)物水平能減輕心肌缺血-再灌注損傷。
【圖文】：

第三章結(jié)果仁素Alpha一M》·Hce一one26一Nc一質(zhì)質(zhì)粒(PcDNA3.1一Nd)的構(gòu)建與鑒定coRI酶切位點(diǎn)的引物，，通過PCR方法從小鼠閱讀框架序列，插入載體質(zhì)粒PcDNA3.1中，嚨coRI酶切鑒定。質(zhì)粒酶切后電泳結(jié)果(帶，大小符合載體質(zhì)粒長(zhǎng)度與插入片段長(zhǎng)度符合小鼠核仁素基因開放閱讀框架(圖2)。

核仁素基因mRNA水平及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體(PcDNA3.l)的細(xì)胞的相比，轉(zhuǎn)染小鼠核仁素表達(dá)質(zhì)粒(peDNA3.1一Ncl)細(xì)胞中核仁素的n1RNA(圖3)和蛋白質(zhì)(圖4)表達(dá)水平明顯增加。該結(jié)果提示PcDNA3.1一Ncl能在真核細(xì)胞中有效表達(dá)核仁素�？� .1232000bP1000bP750b500bP核仁素250bP600bP500bPGAPDH圖3M:采用RT-PcR分析peDNA3.1一Ncl瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HgcZ細(xì)胞后核仁素mRNA的表達(dá)情況 DNAMarker;1:正常HgcZ細(xì)胞;2:轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒peDNA3，1細(xì)胞;3:轉(zhuǎn)染PcDNA3.l一Nel細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 鄒江;王慷慨;劉可;易宇欣;鄂順梅;張玲莉;肖獻(xiàn)忠;;核仁素反義寡核苷酸對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J];醫(yī)學(xué)臨床研究;2005年12期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 張彬;核仁素在大鼠缺血—再灌注損傷心肌中的表達(dá)及其抗心肌細(xì)胞凋亡作用研究[D];中南大學(xué);2009年

2 蔣碧梅;核仁素在大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)中的作用及其機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2566777