【摘要】：目的：對(duì)從臨床分離的弗勞地枸櫞酸桿菌（標(biāo)本號(hào)90757）產(chǎn)生的CMY-39型AmpC酶蛋白進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)和酶特性研究。 方法：（1）對(duì)弗勞地枸櫞酸桿菌作頭孢西丁敏感試驗(yàn)及三維試驗(yàn)以檢測(cè)AmpC酶，提取菌株質(zhì)粒進(jìn)行CIT序列擴(kuò)增并確定其基因分型。 （2）參照Genbank上的CMY-39型AmpC酶基因序列設(shè)計(jì)合成CMY-39基因的PCR引物，以90757號(hào)菌的總基因組作為模板，PCR擴(kuò)增CMY-39的編碼基因，將CMY-39的PCR產(chǎn)物純化后與pGEM-T載體連接，測(cè)定CMY-39的核苷酸序列。 （3）將CMY-39基因克隆到PET-32a(+)系統(tǒng)進(jìn)行重組，，重組質(zhì)粒在大腸埃希菌BL21（DE3）中表達(dá)，SDS-PAGE電泳鑒定酶蛋白的表達(dá)。 （4）取CMY-39重組菌和原菌株進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，提取重組菌的CMY-39蛋白進(jìn)行三維試驗(yàn)和Western blot檢測(cè)，并對(duì)此酶蛋白進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果：（1）證實(shí)90757號(hào)菌株為產(chǎn)CMY-39型AmpC酶的弗勞地枸櫞酸桿菌，序列分析結(jié)果顯示目的基因片段長(zhǎng)1146bp，經(jīng)GenBank同源性比較，目的基因的氨基酸序列與GenBank上登錄的CMY-39編碼基因同源性為99％，它是CMY-39的突變株，為新型的CMY基因型，GenBank登陸號(hào)為HM565135。 （2）成功構(gòu)建PET32a(+)/CMY-39重組質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，得到大小為1146bp和5901bp左右的片斷。 （3）SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，重組菌株經(jīng)18℃誘導(dǎo)過夜后可見明顯特異性表達(dá)條帶，分子量約60KD。 （4）藥物敏感試驗(yàn)顯示，CMY-39重組菌株保持了產(chǎn)CMY型酶菌株的耐藥特征，對(duì)第一、二代頭孢菌素和頭霉素類表現(xiàn)為耐藥，對(duì)第三、四代頭孢菌素，氨基糖苷類和碳青霉烯類表現(xiàn)為敏感，耐藥性不被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，如他唑巴坦抑制。 （5）酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示，重組酶測(cè)定的Km值與原菌株相比，均有不同程度的升高，表明重組酶與底物的親和力下降。 結(jié)論：（1）重組菌所產(chǎn)的AmpC酶基因型為CMY-39新基因亞型，登陸號(hào)為HM565135。 （2）在PET32a/BL21系統(tǒng)中成功表達(dá)重組的CMY-39型酶。 （3）重組菌與原菌株比較，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性和穩(wěn)定性增加，親和力下降。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R3416

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2566548