【摘要】：研究背景： 調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,增加機(jī)體的抗損傷能力是預(yù)防和治療缺血/再灌注心臟損傷的重要措施之一。缺血后處理是于組織長期缺血后、再灌注之前進(jìn)行反復(fù)短暫的再灌注/缺血處理,以減輕缺血/再灌注所致的組織損傷的一種方法,是迄今已知最強(qiáng)的內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)現(xiàn)象之一。但是其保護(hù)機(jī)制的分子靶點(diǎn)尚不清楚。 線粒體凋亡途徑是缺血/再灌注誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,造成心肌損傷的主要途徑。而抑制心肌細(xì)胞凋亡又是缺血后處理保護(hù)心肌的關(guān)鍵所在。由此產(chǎn)生的問題是：缺血后處理是否通過調(diào)控參與線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵分子來發(fā)揮作用呢?PUMA (p53upregulated modulator of apoptosis)是位于線粒體的p53靶基因,它具有強(qiáng)大的促凋亡功能。ARC是迄今為止在心臟發(fā)現(xiàn)的高度特異,且大量表達(dá)的抗凋亡蛋白,其全稱是帶有caspase富集功能域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with a caspase recuitment domain,簡稱ARC)。研究已經(jīng)證實(shí)ARC和PUMA是調(diào)控線粒體凋亡途徑的重要分子。既然缺血后處理具有明確的抗線粒體凋亡途徑的作用,而PUMA和ARC的促凋亡作用和抗凋亡作用又是以線粒體為靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的,那么,缺血后處理是否以PUMA和ARC為靶分子,通過抑制線粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)其心肌保護(hù)作用呢?目前尚不清楚。 研究目的： 采用體外培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞缺氧后處理模型(模擬整體水平缺血后處理模型),研究調(diào)控PUMA和ARC表達(dá)與缺氧后處理抑制線粒體凋亡途徑的關(guān)系,證實(shí)缺氧后處理通過下調(diào)PUMA的表達(dá)、上調(diào)ARC的表達(dá),抑制線粒體凋亡途徑,實(shí)現(xiàn)其心肌保護(hù)作用。 研究方法： 1.乳大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧和缺氧后處理模型的建立：培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞置于缺氧倉中缺氧3h后,持續(xù)復(fù)氧3h復(fù)制缺氧/復(fù)氧模型。培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞置于缺氧倉中缺氧3h后,持續(xù)復(fù)氧之前進(jìn)行3次反復(fù)短暫的復(fù)氧／缺氧處理,復(fù)制缺氧后處理模型。 2.心肌細(xì)胞凋亡的研究：用Propidium Iodide和Annexin-V標(biāo)記心肌細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測法研究心肌細(xì)胞凋亡的變化。 3.心肌細(xì)胞死亡率的研究：用臺(tái)盼藍(lán)染色法研究心肌細(xì)胞死亡的變化。 4.檢測PUMA和ARC蛋白表達(dá)：提取心肌細(xì)胞總蛋白,采用Western blot方法研究PUMA和ARC蛋白表達(dá)的變化。 5.檢測細(xì)胞色素c和Bax在線粒體和胞漿中的表達(dá)：提取心肌細(xì)胞線粒體和胞漿,采用Western blot方法研究細(xì)胞色素c和Bax表達(dá)的變化。 6. caspase-3活性的檢測：采用caspase-3活性檢測試劑盒研究caspase-3活性的變化。 7.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(夏±s)表示,以統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0分析,多組間兩兩比較用Bonferroni's test,P0.05認(rèn)為具有顯著性差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.缺氧后處理下調(diào)PUMA,減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷 (1)缺氧/復(fù)氧上調(diào)PUMA,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡：與常氧培養(yǎng)的對(duì)照組比較,缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞PUMA mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P0.001),與此同時(shí),心肌細(xì)胞凋亡率和的死亡率明顯高于對(duì)照組(P0.001)。而用siRNA抑制內(nèi)源性PUMA的表達(dá)后再進(jìn)行缺氧/復(fù)氧,心肌細(xì)胞凋亡率和死亡率明顯降低,與單純?nèi)毖?復(fù)氧組比較,差異顯著(P0.001)。 (2)缺氧后處理通過抑制PUMA表達(dá)減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷：在心肌細(xì)胞缺氧后復(fù)氧前進(jìn)行3次反復(fù)短暫的復(fù)氧/缺氧處理,以復(fù)制缺氧后處理模型,研究缺氧后處理?xiàng)l件下PUMA mRNA和蛋白表達(dá)以及心肌細(xì)胞的凋亡率和死亡率的變化。結(jié)果顯示：缺氧后處理明顯下調(diào)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的PUMA mRNA和蛋白表達(dá)(與缺氧/復(fù)氧比較P0.001)。與之相應(yīng)的是,給予缺氧后處理的心肌細(xì)胞凋亡率和死亡率明顯減少(與缺氧/復(fù)氧比較P0.001)。但是當(dāng)用ad-PUMA腺病毒感染心肌細(xì)胞,獲得過表達(dá)PUMA的心肌細(xì)胞后,然后進(jìn)行缺氧后處理,明顯降低缺氧后處理的細(xì)胞保護(hù)作用,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞凋亡率和死亡率明顯高于單純的缺氧后處理組(P0.001)。 2.ARC在缺氧后處理心肌保護(hù)中作用的研究 (1)生理?xiàng)l件下ARC在心肌細(xì)胞存活中的作用：分別用antisense-ARC和scramble-ARC轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)：antisense-ARC抑制內(nèi)源性ARC蛋白表達(dá)的同時(shí),可以增加心肌細(xì)胞凋亡率和死亡率(P0.05)；而scramble-ARC對(duì)內(nèi)源性ARC蛋白表達(dá)以及心肌細(xì)胞凋亡率和死亡率無明顯影響(P0.05)。 (2)研究ARC是心肌細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧條件下存活的關(guān)鍵因子：缺氧/復(fù)氧可以明顯下調(diào)ARC的蛋白表達(dá),增加心肌細(xì)胞的凋亡率和死亡率(P0.05)。而用ARC腺病毒感染心肌細(xì)胞后,獲得ARC過表達(dá)的心肌細(xì)胞,然后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理,心肌細(xì)胞的凋亡率和死亡率明顯低于缺氧/復(fù)氧組(P0.05)。但是用β-gal腺病毒感染心肌細(xì)胞,再進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理,心肌細(xì)胞的凋亡率和死亡率與單純的缺氧/復(fù)氧組比較無顯著性差異(P0.05)。 (3)探究ARC在缺氧后處理抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌損傷中的作用：缺氧后處理在明顯抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的ARC蛋白表達(dá)下調(diào)的同時(shí),可以明顯降低缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡率和死亡率增加(P0.01)。但是用antisense-ARC抑制內(nèi)源性ARC的表達(dá),缺氧后處理對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡率和死亡率的抑制作用明顯降低(P0.01)。而用scramble-ARC轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,缺氧后處理對(duì)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用無明顯變化(P0.05)。 3.缺氧后處理以PUMA和ARC為靶分子抑制心肌細(xì)胞凋亡的途徑研究 (1)缺氧后處理以PUMA和ARC為靶分子抑制線粒體膜電位減低：缺氧后處理可以明顯抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降(P0.01,與缺氧／復(fù)氧組比較)。與此相對(duì)照,用adPUMA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞獲得PUMA過表達(dá)細(xì)胞或者antisense-ARC抑制內(nèi)源性ARC的表達(dá)后,再進(jìn)行缺氧后處理,線粒體膜電位與單純的缺氧后處理組比較差異顯著(P0.01)。而用β-gal或scramble-ARC轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,再進(jìn)行缺氧后處理,線粒體膜電位與單純的缺氧后處理組比較無顯著性差異(P0.05)。 (2)缺氧后處理以PUMA和ARC為靶分子抑制細(xì)胞色素c釋放和Bax轉(zhuǎn)位：正常對(duì)照組Bax表達(dá)在胞漿中,細(xì)胞色素c表達(dá)在線粒體中。在缺氧／復(fù)氧條件下,Bax從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體,細(xì)胞色素c從線粒體釋放至胞漿。而給予缺氧后處理細(xì)胞,Bax在線粒體中的表達(dá)和細(xì)胞色素c在胞漿中的表達(dá)明顯減少。與此相對(duì)照,當(dāng)用adPUMA或antisense-ARC轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,然后研究PUMA基因過表達(dá)或者ARC基因被抑制后缺氧后處理對(duì)Bax轉(zhuǎn)位和細(xì)胞色素c釋放的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)PUMA或者降低內(nèi)源性ARC的表達(dá)后可以明顯抑制缺氧后處理對(duì)Bax轉(zhuǎn)位和細(xì)胞色素c釋放的阻斷作用。 研究結(jié)論： 1.缺血后處理通過下調(diào)促凋亡因子PUMA的表達(dá),上調(diào)抗凋亡因子ARC的表達(dá),抑制缺血／再灌注所致心肌細(xì)胞損傷。 2.缺血后處理以PUMA和ARC為靶分子,通過抑制線粒體凋亡途徑,發(fā)揮其抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363.2

【共引文獻(xiàn)】

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