【摘要】：研究背景 肺間質(zhì)纖維化(pulmonary fibrosis, PF)的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚,它是多種細(xì)胞因子及其網(wǎng)絡(luò)共同參與的疾病,以肺組織的慢性炎癥、膠原沉積、肺組織結(jié)構(gòu)重塑和慢性纖維組織增生為病理特征,最終可導(dǎo)致呼吸功能衰竭而死亡。肺間質(zhì)纖維化臨床變數(shù)大,預(yù)后差,特別是特發(fā)肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF),確診后平均存活時(shí)間不超過(guò)3-5年,目前多采用西藥治療,傳統(tǒng)的治療藥物是糖皮質(zhì)激素,或聯(lián)合免疫抑制劑,但治療的有效率低及副作用大,多數(shù)患者耐受性差,難以長(zhǎng)期堅(jiān)持使用；抗氧化劑、蛋白酶抑制劑、基因治療及中醫(yī)中藥治療等治療方法,尚無(wú)充分的臨床數(shù)據(jù)支持,仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。目前有效治療手段的缺乏及發(fā)病率的不斷增加給國(guó)家、社會(huì)和個(gè)人造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān),因此,尋找肺間質(zhì)纖維化的有效治療手段迫在眉睫。 近年來(lái),隨著肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制研究的不斷進(jìn)行和深入,諸多關(guān)于調(diào)控、啟動(dòng)和促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化的機(jī)制不斷涌現(xiàn)。許多研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming grow factor-(31, TGF-β1)和腫瘤壞死因子-a (tumor necrosis factor-a, TNF-a)與肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。 生物醫(yī)學(xué)的研究表明,人類(lèi)疾病的發(fā)生、發(fā)展都直接或間接與基因有關(guān)。RNA干擾技術(shù)是利用與靶基因同源的雙鏈RNA (double strand RNA, ds RNA)誘導(dǎo)靶基因mRNA降解從而引起特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNA干擾技術(shù)的有效載體是小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA),因此,siRNA和RNAi的研究和應(yīng)用,均具有重要的意義,有可能成為疾病基因靶向治療的工具和手段。 目的 構(gòu)建針對(duì)腫瘤壞死因子-α (TNF-α)基因的小干擾RNA (siRNA)真核表達(dá)載體,觀察載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞中TNF-α基因表達(dá)的沉默效應(yīng),探索肺間質(zhì)纖維化基因靶向治療的可能性。 材料與方法 1.依據(jù)GenBank中人TNF-α (NM_000594)序列和Clontech公司的RNAi Designer軟件靶序列設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)并體外合成一對(duì)針對(duì)TNF-α的特異性序列(siTNF)和一對(duì)無(wú)關(guān)序列(siCon)。退火合成DNA雙鏈,再分別重組入pRNAT-U6.1表達(dá)載體,經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增鑒定,并送上海生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。 2.將構(gòu)建好的重組載體(pRNAT-U6.1-siTNF、PRNAT-U6.1-siCon)及空載體(pRNAT-U6.1)用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞株,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。 3.以未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染PRNAT-U6.1-siCon組和轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1組作為對(duì)照,分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 4.數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)方法為單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。 結(jié)果 1.確定siTNF和siCon的基因序列,兩端分別加入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切殘基,并體外成功合成編碼TNF-α基因的DNA寡聚核苷酸單鏈。 2.PCR和DNA測(cè)序鑒定證實(shí)退火片段插入pRNAT-U6.1,并且與設(shè)計(jì)序列完全一致。 3.轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞后,轉(zhuǎn)染PRNAT-U6.1-siTNF的A549細(xì)胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)水平,與未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siCon和轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1的人肺腺癌A549細(xì)胞比較均顯著降低(P0.05),而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siCon細(xì)胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論 成功設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建出針對(duì)TNF-α基因的siRNA真核表達(dá)載體,通過(guò)轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞,能夠有效沉默人肺腺癌A549細(xì)胞中TNF-α基因的表達(dá),在細(xì)胞TNF-α基因表達(dá)沉默的同時(shí),細(xì)胞中TGF-β1基因表達(dá)亦受到抑制。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2565477