【摘要】：第一部分甘氨酸對果糖飲食致大鼠發(fā)生MS及腸黏膜屏障影響的研究 目的：探討腸源性內(nèi)毒素血癥(IETM)在高果糖飲食致大鼠代謝綜合征(MS)中發(fā)揮的作用,及甘氨酸(glycine)對MS及腸黏膜屏障的保護作用。 方法： 模型組大鼠給予8%的果糖水喂養(yǎng),干預(yù)組給予8%的果糖+1%的甘氨酸水喂養(yǎng)。每月測量大鼠體重及收縮壓,分別于2月、4月、6月、8月處死動物,麻醉后腹主主動脈取血并分離血漿,迅速分離小腸上段,部分置于10%中性福爾馬林,其余樣本-80℃冷凍保存 1、血脂檢測 采用酶法測定血漿甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、總膽固醇(TC)及游離脂肪酸(FFA)水平。 2、檢測血漿內(nèi)毒素、胰島素、促炎因子及胰島素抵抗評估 鱟試劑顯色法檢測血漿內(nèi)毒素(LPS)水平；采用ELISA試劑盒檢測血漿胰島素、TNF-α及IL-10的變化；采用HOMA-IR評估胰島素抵抗(IR)指數(shù),計算公式為：空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(EU/mL)/22.5。 3、小腸組織病理學檢測 小腸組織采用常規(guī)石蠟包埋、切片,切片厚度為5μm,HE染色,鏡下觀測組織病理學變化；采用改良Gomori法檢測腸堿性磷酸酶(AKP)的表達。 結(jié)果： 實驗期間,大鼠狀況良好,模型組大鼠3月～6月體重增加明顯(P0.05,P0.01),3月后收縮壓升高(P0.05,P0.01)。甘氨酸在4月、6月顯著降低模型組體重增長(P0.05,P0.01),4月～6月降低模型組收縮壓的升高(P0.05,P0.01)。 1、血脂變化 模型組2月后血漿TG、TC及FFA水平明顯升高(P0.01,P0.05),HDL-C水平顯著降低(P0.01,P0.05)。甘氨酸顯著降低模型組各時間點血漿TG水平,顯著降低模型組6月、8月血漿FFA水平(P0.01.P0.05)。 2、血漿LPS、胰島素、促炎因子及IR變化 模型組大鼠2月后血漿LPS、胰島素及HOMA-IR顯著升高(P0.01),4月、8月血漿TNF-α及IL-6水平顯著升高(P0.01)。甘氨酸顯著降低模型組血漿LPS、血漿胰島素、HOMA-IR及促炎因子(TNF-α, IL-10)水平(P0.05,P0.01)。 3、血漿LPS與HOMA-IR及FFA的相關(guān)性 血漿LPS水平與HOMA-IR(rs=0.76,P=0.0164)及FFA (rs=0.65,P=0.0001)正相關(guān)。 4、組織病理學變化 模型組大鼠小腸粘膜結(jié)構(gòu)破壞,AKP陽性反應(yīng)明顯減弱,且上述損害明顯表現(xiàn)為時間依賴性。甘氨酸干預(yù)可明顯改善模型組小腸組織病理損傷及AKP表達。 結(jié)論： 1、高果糖飲食可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生MS,表現(xiàn)為肥胖、糖耐量異常、IR、異常脂血癥、高血壓等,這可能與伴有IETM所致的IR(特別是肝IR)密切相關(guān)。甘氨酸通過減輕IETM進而改善IR、炎癥,對高果糖飲食誘導(dǎo)的MS發(fā)揮明顯保護作用。 2、高果糖飲食所致模型組大鼠發(fā)生MS時伴有IETM,表現(xiàn)為腸壁結(jié)構(gòu)破壞、通透性增加及腸APK表達下降。甘氨酸通過減輕腸壁結(jié)構(gòu)破壞和增加小腸APK表達使高果糖飲食誘導(dǎo)的IETM明顯減輕。 第二部分IETM在果糖飲食所致與MS相關(guān)疾病中的作用及甘氨酸的保護機制 目的： 探討IETM在高果糖飲食所致大鼠發(fā)生與MS相關(guān)疾病(非酒精性肝病、Ⅱ型糖尿病、代謝性高血壓)中的作用,及甘氨酸的保護機制。 方法： 模型組大鼠以8%的果糖水喂養(yǎng),甘氨酸干預(yù)組給予8%的果糖+1%的甘氨酸水喂養(yǎng)。每月末檢測大鼠收縮壓的變化。分別于4月、8月處死動物,麻醉后腹主動脈取血并分離血漿,迅速分離迅速分離肝臟、胰腺、胸主動脈及腹部脂肪組織,部分置于10%中性福爾馬林,其余樣本-80℃冷凍保存。 1、血漿相關(guān)指標的檢測 酶法檢測血糖、血漿NO及FFA水平變化；ELISA法檢測血漿胰島素、TNF-α、IL-6、內(nèi)皮素1(ET-1)及血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)水平變化；計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)及β細胞功能指數(shù),公式為：HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(EU/mL)/22.5, HOMA-β=20×血漿胰島素(mmol/L)/[空腹血.糖(mmol/L)-3.5];鱟試劑顯色法檢測血漿內(nèi)毒素(LPS)水平變化,并分析其與HOMA-IR、FFA的相關(guān)性。 2、組織病理學檢測 肝臟、胰腺、血管采用常規(guī)石蠟包埋切片,切片厚度為5μm,HE染色,光鏡下觀察各組織病理學改變。 3、免疫組化檢測 血管內(nèi)皮源型一氧化氮合酶(eNOS)檢測按照免疫組化原位雜交二步法,肝臟CD68檢測采用免疫組化LP法進行。每組取5張切片,每張取5個視野,運用IPP6.0軟件分析eNOs及CD68免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)。 4、胰島β細胞凋亡水平檢測 胰腺β細胞凋亡采用原位雜交二步法進行檢測。每組取5張切片,每張取5個視野,運用IPP6.0軟件分析細胞凋亡率。 5、RT-PCR檢測 內(nèi)皮素-A受體(ET-AR) mRNA及脂肪組織血管緊張素原mRNA表達采用熒光定量RT-PCR分析,按-2ΔΔCt法得到標準曲線,溶解曲線和樣本的相對定量。 結(jié)果： 實驗期間,大鼠狀況良好,模型組大鼠3月后收縮壓升高(P0.05,P0.01)。甘酸胺在4月～6月顯著降低模型組收縮壓的升高(P0.05,P0.01)。 1、血漿指標變化 與對照組比較,模型組4月、8月血糖、胰島素、TNF-α、IL-6、ET-1、HOMA-IR、LPS及ANGⅡ水平顯著升高(P0.01,P0.05)；血漿NO水平顯著降低(P0.01)；但各階段之間上述指標未見明顯差異。甘氨酸顯著降低模型組4月、8月血漿胰島素、TNF-a及IL-6、ET-1、HOMA-IR、LPS水平(P0.05,P0.01)；明顯降低4月血漿ANGⅡ水平；顯著提高4月血漿NO水平(P0.01)。血漿LPS水平與HOMA-IR (rs=0.76,P=0.0164)及FFA(rs=0.65,P=0.0001)正相關(guān)。 2、組織病理學結(jié)果 肝臟病理學結(jié)果顯示,模型組大鼠2月發(fā)生明顯脂變,8月時發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎(NASH)。隨著高果糖飲食喂養(yǎng)時間的延長,模型組大鼠胰島變得肥大、增生,8月出現(xiàn)明顯萎縮。甘氨酸干預(yù)在不同時間明顯改善模型組上述組織病理損傷。8月時模型組大鼠血管中膜平滑肌僅表現(xiàn)為略有增生。 3、免疫組化結(jié)果 4月、8月模型組肝臟CD68陽性表達明顯高于對照組(P0.01),且隨時間延長陽性細胞表達數(shù)量增加；甘氨酸干預(yù)可明顯降低模型組4月、8月CD68陽性表達(P0.05)。模型組在不同時間點eNOS陽性著色明顯少于對照組(P0.01),且8月更加明顯。甘氨酸明顯提高模型組4月eNOS陽性表達(P0.05)。 4、胰島β細胞凋亡檢測結(jié)果 模型組胰島β細胞凋亡明顯多于對照組(P0.01),且隨時間延長凋亡細胞數(shù)量逐漸增加。甘氨酸明顯降低模型組6月、8月胰島β細胞凋亡數(shù)量(P0.05)。 5、RT-PCR結(jié)果 PCR結(jié)果顯示,模型組ETA-R mRNA在4月、8月表達明顯高于對照組組(P0.01)；血管緊張素原mRNA4月表達明顯高于對照組(P0.01)。甘氨酸顯著降低模型ETA-R及血管緊張素原mRNA表達(P0.01)。 結(jié)論： 1、高果糖飲食可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生MS相關(guān)的NAFLD、T2DM及代謝性高血壓病。這些疾病共同的病理生理基礎(chǔ)為IETM所誘發(fā)的IR與慢性低度炎癥。 2、高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠發(fā)生MS相關(guān)的NAFLD、T2DM和代謝性高血壓發(fā)病中,均伴有IETM、炎癥及IR/高胰島素血癥。IETM通過啟動炎癥機制參與IR的發(fā)生。 3、甘氨酸通過減輕IETM,進而改善炎癥及IR,對MS相關(guān)的代謝性疾病(NAFLD、T2DM、代謝性高血壓)發(fā)揮明顯保護作用。 第三部分IETM在果糖飲食誘發(fā)的早期AD樣病變中的作用及甘氨酸的保護機制 目的： 探討IETM在長期高果糖飲食致大鼠發(fā)生早期阿爾茨海默病(AD)病變中,對認知功能損害、中樞Aβ1-40聚集及腦組織tau蛋白過度磷酸化的影響,及甘氨酸的保護作用。 方法： 模型組大鼠以8%的果糖水喂養(yǎng),甘氨酸干預(yù)組給予8%的果糖+1%的甘氨酸水喂養(yǎng)。8月末在結(jié)束認知功能實驗后處死動物,麻醉后腹主動脈采血并分離血漿,迅速分離大腦皮層,部分置于10%中性福爾馬林,其余樣本-80℃冷凍保存。 1、血漿指標檢測 采用酶法分別測定血漿甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)及血糖水平；ELISA法檢測血漿胰島素變化；血漿內(nèi)毒素(LPS)檢測采用鱟試劑鱟試劑顯色法；計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),公式為：空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(EU/mL)/22.5。 2、促炎因子檢測 血漿及腦組織(10%腦皮層均漿)TNF-α和IL-6的檢測采用ELISA法進行。 3、血漿及腦組織Aβ1-40檢測 采用ELLISA試劑盒檢測血漿及腦組織(10%腦皮層均漿)淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)水平。 4、腦組織病理學檢測 腦組織采用常規(guī)石蠟包埋切片,切片厚度為5μm,HE染色,鏡下觀測腦組織病理學變化。采用改良Bielschowsky法檢測腦組織老年斑(SP)。 5、認知功能測試 采用Morris水迷宮測試各組大鼠認知功能。 6、Western blot分析 采用Western blot檢測腦組織胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白胰島素受體β亞單位(IRp)、磷脂酰肌醇3-激酶α亞單位(PI3-kα)及其磷酸化蛋白、磷酸化tau蛋白的表達。 結(jié)果： 1、血漿指標變化 模型組血漿TG、HDL-C、TC、FFA及血糖水平明顯升高(P0.01),血漿LPS、胰島素及HOMA-IR水平顯著高于對照組(P0.01)。甘氨酸顯著降低模型組血漿TG、FFA、血糖、胰島素、LPS、HOMA-IR水平(P0.01)。 2、促炎因子變化 模型組大鼠血漿及腦組織TNF-α和IL-6平顯著升高(P0.01)。甘氨酸顯著降低模型組血漿及腦組織促炎因子表達(P0.05)。 3、血漿及腦組織Aβ1-40變化 模型組大鼠血漿及腦組織Aβ1-40水平明顯高于對照組(P0.01),甘氨酸可降低模型組血漿及腦組織Aβ1-40水平,但變化無統(tǒng)計學差異。 4、組織病理學結(jié)果 模型組大鼠CA4區(qū)部分神經(jīng)細胞變性,核固縮、濃染。模型組部分大鼠大腦深層出現(xiàn)類似于人類AD的SP,但數(shù)量及大小均不規(guī)則。甘氨酸干預(yù)后,部分大鼠大腦深層仍存在SP,但數(shù)量減少。 5、Morris水迷宮結(jié)果 模型組平均逃避潛伏期明顯長于對照組(P0.01),甘氨酸可顯著縮短模型組第4天、5天平均逃避潛伏期(P0.05)�？臻g探索實驗結(jié)果顯示,模型組大鼠在目標象限所占時間與總時間的百分比顯著降低(P0.05),甘氨酸可顯著提高該百分比(P0.05)。 6、Western blot結(jié)果 模型組皮層pIRβTyr1162/1163/IRβ、p-PI3-kp85αTyr508/PI3-kp85比值顯著降低(P0.01),p-tauSer262蛋白表達顯著升高(P0.01)。甘氨酸顯可顯著提高了兩種蛋白的比值(P0.01),明顯降低p-tauSer262蛋白表達(P0.05)。 結(jié)論： 長期高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠發(fā)生類似人類AD的早期病變,表現(xiàn)為認知功能損害、腦組織Aβ1-40水平升高、磷酸化tau蛋白表達增加及腦組織出現(xiàn)SP,其特征有中樞與外周胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常(IR)與輕度炎癥反應(yīng)。甘氨酸通過減輕IETM進而改善炎癥、IR從而對模型組大鼠發(fā)揮明顯的保護作用。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2564104