【摘要】：第一部分甘氨酸對(duì)果糖飲食致大鼠發(fā)生MS及腸黏膜屏障影響的研究 目的：探討腸源性?xún)?nèi)毒素血癥(IETM)在高果糖飲食致大鼠代謝綜合征(MS)中發(fā)揮的作用,及甘氨酸(glycine)對(duì)MS及腸黏膜屏障的保護(hù)作用。 方法： 模型組大鼠給予8%的果糖水喂養(yǎng),干預(yù)組給予8%的果糖+1%的甘氨酸水喂養(yǎng)。每月測(cè)量大鼠體重及收縮壓,分別于2月、4月、6月、8月處死動(dòng)物,麻醉后腹主主動(dòng)脈取血并分離血漿,迅速分離小腸上段,部分置于10%中性福爾馬林,其余樣本-80℃冷凍保存 1、血脂檢測(cè) 采用酶法測(cè)定血漿甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、總膽固醇(TC)及游離脂肪酸(FFA)水平。 2、檢測(cè)血漿內(nèi)毒素、胰島素、促炎因子及胰島素抵抗評(píng)估 鱟試劑顯色法檢測(cè)血漿內(nèi)毒素(LPS)水平；采用ELISA試劑盒檢測(cè)血漿胰島素、TNF-α及IL-10的變化；采用HOMA-IR評(píng)估胰島素抵抗(IR)指數(shù),計(jì)算公式為：空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(EU/mL)/22.5。 3、小腸組織病理學(xué)檢測(cè) 小腸組織采用常規(guī)石蠟包埋、切片,切片厚度為5μm,HE染色,鏡下觀測(cè)組織病理學(xué)變化；采用改良Gomori法檢測(cè)腸堿性磷酸酶(AKP)的表達(dá)。 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)期間,大鼠狀況良好,模型組大鼠3月～6月體重增加明顯(P0.05,P0.01),3月后收縮壓升高(P0.05,P0.01)。甘氨酸在4月、6月顯著降低模型組體重增長(zhǎng)(P0.05,P0.01),4月～6月降低模型組收縮壓的升高(P0.05,P0.01)。 1、血脂變化 模型組2月后血漿TG、TC及FFA水平明顯升高(P0.01,P0.05),HDL-C水平顯著降低(P0.01,P0.05)。甘氨酸顯著降低模型組各時(shí)間點(diǎn)血漿TG水平,顯著降低模型組6月、8月血漿FFA水平(P0.01.P0.05)。 2、血漿LPS、胰島素、促炎因子及IR變化 模型組大鼠2月后血漿LPS、胰島素及HOMA-IR顯著升高(P0.01),4月、8月血漿TNF-α及IL-6水平顯著升高(P0.01)。甘氨酸顯著降低模型組血漿LPS、血漿胰島素、HOMA-IR及促炎因子(TNF-α, IL-10)水平(P0.05,P0.01)。 3、血漿LPS與HOMA-IR及FFA的相關(guān)性 血漿LPS水平與HOMA-IR(rs=0.76,P=0.0164)及FFA (rs=0.65,P=0.0001)正相關(guān)。 4、組織病理學(xué)變化 模型組大鼠小腸粘膜結(jié)構(gòu)破壞,AKP陽(yáng)性反應(yīng)明顯減弱,且上述損害明顯表現(xiàn)為時(shí)間依賴(lài)性。甘氨酸干預(yù)可明顯改善模型組小腸組織病理?yè)p傷及AKP表達(dá)。 結(jié)論： 1、高果糖飲食可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生MS,表現(xiàn)為肥胖、糖耐量異常、IR、異常脂血癥、高血壓等,這可能與伴有IETM所致的IR(特別是肝IR)密切相關(guān)。甘氨酸通過(guò)減輕IETM進(jìn)而改善IR、炎癥,對(duì)高果糖飲食誘導(dǎo)的MS發(fā)揮明顯保護(hù)作用。 2、高果糖飲食所致模型組大鼠發(fā)生MS時(shí)伴有IETM,表現(xiàn)為腸壁結(jié)構(gòu)破壞、通透性增加及腸APK表達(dá)下降。甘氨酸通過(guò)減輕腸壁結(jié)構(gòu)破壞和增加小腸APK表達(dá)使高果糖飲食誘導(dǎo)的IETM明顯減輕。 第二部分IETM在果糖飲食所致與MS相關(guān)疾病中的作用及甘氨酸的保護(hù)機(jī)制 目的： 探討IETM在高果糖飲食所致大鼠發(fā)生與MS相關(guān)疾病(非酒精性肝病、Ⅱ型糖尿病、代謝性高血壓)中的作用,及甘氨酸的保護(hù)機(jī)制。 方法： 模型組大鼠以8%的果糖水喂養(yǎng),甘氨酸干預(yù)組給予8%的果糖+1%的甘氨酸水喂養(yǎng)。每月末檢測(cè)大鼠收縮壓的變化。分別于4月、8月處死動(dòng)物,麻醉后腹主動(dòng)脈取血并分離血漿,迅速分離迅速分離肝臟、胰腺、胸主動(dòng)脈及腹部脂肪組織,部分置于10%中性福爾馬林,其余樣本-80℃冷凍保存。 1、血漿相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 酶法檢測(cè)血糖、血漿NO及FFA水平變化；ELISA法檢測(cè)血漿胰島素、TNF-α、IL-6、內(nèi)皮素1(ET-1)及血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)水平變化；計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)及β細(xì)胞功能指數(shù),公式為：HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(EU/mL)/22.5, HOMA-β=20×血漿胰島素(mmol/L)/[空腹血.糖(mmol/L)-3.5];鱟試劑顯色法檢測(cè)血漿內(nèi)毒素(LPS)水平變化,并分析其與HOMA-IR、FFA的相關(guān)性。 2、組織病理學(xué)檢測(cè) 肝臟、胰腺、血管采用常規(guī)石蠟包埋切片,切片厚度為5μm,HE染色,光鏡下觀察各組織病理學(xué)改變。 3、免疫組化檢測(cè) 血管內(nèi)皮源型一氧化氮合酶(eNOS)檢測(cè)按照免疫組化原位雜交二步法,肝臟CD68檢測(cè)采用免疫組化LP法進(jìn)行。每組取5張切片,每張取5個(gè)視野,運(yùn)用IPP6.0軟件分析eNOs及CD68免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。 4、胰島β細(xì)胞凋亡水平檢測(cè) 胰腺β細(xì)胞凋亡采用原位雜交二步法進(jìn)行檢測(cè)。每組取5張切片,每張取5個(gè)視野,運(yùn)用IPP6.0軟件分析細(xì)胞凋亡率。 5、RT-PCR檢測(cè) 內(nèi)皮素-A受體(ET-AR) mRNA及脂肪組織血管緊張素原mRNA表達(dá)采用熒光定量RT-PCR分析,按-2ΔΔCt法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),溶解曲線(xiàn)和樣本的相對(duì)定量。 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)期間,大鼠狀況良好,模型組大鼠3月后收縮壓升高(P0.05,P0.01)。甘酸胺在4月～6月顯著降低模型組收縮壓的升高(P0.05,P0.01)。 1、血漿指標(biāo)變化 與對(duì)照組比較,模型組4月、8月血糖、胰島素、TNF-α、IL-6、ET-1、HOMA-IR、LPS及ANGⅡ水平顯著升高(P0.01,P0.05)；血漿NO水平顯著降低(P0.01)；但各階段之間上述指標(biāo)未見(jiàn)明顯差異。甘氨酸顯著降低模型組4月、8月血漿胰島素、TNF-a及IL-6、ET-1、HOMA-IR、LPS水平(P0.05,P0.01)；明顯降低4月血漿ANGⅡ水平；顯著提高4月血漿NO水平(P0.01)。血漿LPS水平與HOMA-IR (rs=0.76,P=0.0164)及FFA(rs=0.65,P=0.0001)正相關(guān)。 2、組織病理學(xué)結(jié)果 肝臟病理學(xué)結(jié)果顯示,模型組大鼠2月發(fā)生明顯脂變,8月時(shí)發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎(NASH)。隨著高果糖飲食喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),模型組大鼠胰島變得肥大、增生,8月出現(xiàn)明顯萎縮。甘氨酸干預(yù)在不同時(shí)間明顯改善模型組上述組織病理?yè)p傷。8月時(shí)模型組大鼠血管中膜平滑肌僅表現(xiàn)為略有增生。 3、免疫組化結(jié)果 4月、8月模型組肝臟CD68陽(yáng)性表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P0.01),且隨時(shí)間延長(zhǎng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量增加；甘氨酸干預(yù)可明顯降低模型組4月、8月CD68陽(yáng)性表達(dá)(P0.05)。模型組在不同時(shí)間點(diǎn)eNOS陽(yáng)性著色明顯少于對(duì)照組(P0.01),且8月更加明顯。甘氨酸明顯提高模型組4月eNOS陽(yáng)性表達(dá)(P0.05)。 4、胰島β細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 模型組胰島β細(xì)胞凋亡明顯多于對(duì)照組(P0.01),且隨時(shí)間延長(zhǎng)凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。甘氨酸明顯降低模型組6月、8月胰島β細(xì)胞凋亡數(shù)量(P0.05)。 5、RT-PCR結(jié)果 PCR結(jié)果顯示,模型組ETA-R mRNA在4月、8月表達(dá)明顯高于對(duì)照組組(P0.01)；血管緊張素原mRNA4月表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P0.01)。甘氨酸顯著降低模型ETA-R及血管緊張素原mRNA表達(dá)(P0.01)。 結(jié)論： 1、高果糖飲食可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生MS相關(guān)的NAFLD、T2DM及代謝性高血壓病。這些疾病共同的病理生理基礎(chǔ)為IETM所誘發(fā)的IR與慢性低度炎癥。 2、高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠發(fā)生MS相關(guān)的NAFLD、T2DM和代謝性高血壓發(fā)病中,均伴有IETM、炎癥及IR/高胰島素血癥。IETM通過(guò)啟動(dòng)炎癥機(jī)制參與IR的發(fā)生。 3、甘氨酸通過(guò)減輕IETM,進(jìn)而改善炎癥及IR,對(duì)MS相關(guān)的代謝性疾病(NAFLD、T2DM、代謝性高血壓)發(fā)揮明顯保護(hù)作用。 第三部分IETM在果糖飲食誘發(fā)的早期AD樣病變中的作用及甘氨酸的保護(hù)機(jī)制 目的： 探討IETM在長(zhǎng)期高果糖飲食致大鼠發(fā)生早期阿爾茨海默病(AD)病變中,對(duì)認(rèn)知功能損害、中樞Aβ1-40聚集及腦組織tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響,及甘氨酸的保護(hù)作用。 方法： 模型組大鼠以8%的果糖水喂養(yǎng),甘氨酸干預(yù)組給予8%的果糖+1%的甘氨酸水喂養(yǎng)。8月末在結(jié)束認(rèn)知功能實(shí)驗(yàn)后處死動(dòng)物,麻醉后腹主動(dòng)脈采血并分離血漿,迅速分離大腦皮層,部分置于10%中性福爾馬林,其余樣本-80℃冷凍保存。 1、血漿指標(biāo)檢測(cè) 采用酶法分別測(cè)定血漿甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)及血糖水平；ELISA法檢測(cè)血漿胰島素變化；血漿內(nèi)毒素(LPS)檢測(cè)采用鱟試劑鱟試劑顯色法；計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),公式為：空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(EU/mL)/22.5。 2、促炎因子檢測(cè) 血漿及腦組織(10%腦皮層均漿)TNF-α和IL-6的檢測(cè)采用ELISA法進(jìn)行。 3、血漿及腦組織Aβ1-40檢測(cè) 采用ELLISA試劑盒檢測(cè)血漿及腦組織(10%腦皮層均漿)淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)水平。 4、腦組織病理學(xué)檢測(cè) 腦組織采用常規(guī)石蠟包埋切片,切片厚度為5μm,HE染色,鏡下觀測(cè)腦組織病理學(xué)變化。采用改良Bielschowsky法檢測(cè)腦組織老年斑(SP)。 5、認(rèn)知功能測(cè)試 采用Morris水迷宮測(cè)試各組大鼠認(rèn)知功能。 6、Western blot分析 采用Western blot檢測(cè)腦組織胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白胰島素受體β亞單位(IRp)、磷脂酰肌醇3-激酶α亞單位(PI3-kα)及其磷酸化蛋白、磷酸化tau蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1、血漿指標(biāo)變化 模型組血漿TG、HDL-C、TC、FFA及血糖水平明顯升高(P0.01),血漿LPS、胰島素及HOMA-IR水平顯著高于對(duì)照組(P0.01)。甘氨酸顯著降低模型組血漿TG、FFA、血糖、胰島素、LPS、HOMA-IR水平(P0.01)。 2、促炎因子變化 模型組大鼠血漿及腦組織TNF-α和IL-6平顯著升高(P0.01)。甘氨酸顯著降低模型組血漿及腦組織促炎因子表達(dá)(P0.05)。 3、血漿及腦組織Aβ1-40變化 模型組大鼠血漿及腦組織Aβ1-40水平明顯高于對(duì)照組(P0.01),甘氨酸可降低模型組血漿及腦組織Aβ1-40水平,但變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4、組織病理學(xué)結(jié)果 模型組大鼠CA4區(qū)部分神經(jīng)細(xì)胞變性,核固縮、濃染。模型組部分大鼠大腦深層出現(xiàn)類(lèi)似于人類(lèi)AD的SP,但數(shù)量及大小均不規(guī)則。甘氨酸干預(yù)后,部分大鼠大腦深層仍存在SP,但數(shù)量減少。 5、Morris水迷宮結(jié)果 模型組平均逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P0.01),甘氨酸可顯著縮短模型組第4天、5天平均逃避潛伏期(P0.05)�？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠在目標(biāo)象限所占時(shí)間與總時(shí)間的百分比顯著降低(P0.05),甘氨酸可顯著提高該百分比(P0.05)。 6、Western blot結(jié)果 模型組皮層pIRβTyr1162/1163/IRβ、p-PI3-kp85αTyr508/PI3-kp85比值顯著降低(P0.01),p-tauSer262蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01)。甘氨酸顯可顯著提高了兩種蛋白的比值(P0.01),明顯降低p-tauSer262蛋白表達(dá)(P0.05)。 結(jié)論： 長(zhǎng)期高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠發(fā)生類(lèi)似人類(lèi)AD的早期病變,表現(xiàn)為認(rèn)知功能損害、腦組織Aβ1-40水平升高、磷酸化tau蛋白表達(dá)增加及腦組織出現(xiàn)SP,其特征有中樞與外周胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常(IR)與輕度炎癥反應(yīng)。甘氨酸通過(guò)減輕IETM進(jìn)而改善炎癥、IR從而對(duì)模型組大鼠發(fā)揮明顯的保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 高鑫;胰島素在中樞神經(jīng)對(duì)控制攝食與體質(zhì)量平衡的作用[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年05期

2 田心;王蓓;王長(zhǎng)海;馬靜;;以自發(fā)性高血壓大鼠為模型對(duì)高血壓發(fā)病機(jī)制的研究[J];華中醫(yī)學(xué)雜志;2009年02期

3 龔麗婭;藍(lán)光明;黃秋霞;;替米沙坦改善代謝綜合征患者血管內(nèi)皮功能[J];中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志;2011年05期

4 陳明,李?lèi)?ài)媛;Alzheimer 病與神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)[J];生命的化學(xué)(中國(guó)生物化學(xué)會(huì)通訊);1997年03期

5 張巍,員克明,韓德五;甘氨酸防治大鼠腸源性?xún)?nèi)毒素血癥機(jī)制研究[J];山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2003年02期

6 曹若瑾;錢(qián)玉英;馮明;王玉蘭;王潔妤;陳秉良;;內(nèi)毒素血癥時(shí)老年大鼠肝臟氧自由基代謝及熱休克蛋白70的表達(dá)[J];山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年10期

7 李曉芳;;嚴(yán)重?zé)齻笪改c道功能障礙的機(jī)制和防治[J];世界華人消化雜志;2006年09期

8 陳賢明,許瑞齡,馬學(xué)惠,趙元昌,韓德五;慢性酒精刺激對(duì)結(jié)腸壁大腸桿菌脂多糖通透的影響[J];新消化病學(xué)雜志;1997年05期

9 孫葳;陸大祥;丁勇;李楚杰;;不同pH及封閉氨基端對(duì)甘氨酸拮抗內(nèi)毒素作用的影響[J];中國(guó)病理生理雜志;1997年02期

10 段美麗,王彥軍,韓德五;急性肝功能衰竭時(shí)腸粘膜屏障損傷的研究[J];中國(guó)病理生理雜志;1999年10期

，

本文編號(hào)：2564104