發(fā)布時(shí)間：2019-11-19 04:49

【摘要】：研究目的: 炎癥是一種生存必需的基礎(chǔ)生理過程,但它同時(shí)又是人類疾病的一大誘因。近期的研究表明迷走神經(jīng)能夠通過膽堿能抗炎通路來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),抑制炎癥。乙酰膽堿是迷走神經(jīng)的重要神經(jīng)遞質(zhì),它能夠通過α7尼古丁乙酰膽堿受體(α7-nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)抑制巨噬細(xì)胞中炎癥因子的釋放。尼古丁作為一種選擇性更高的激動(dòng)劑,可以更有效的抑制炎癥因子的產(chǎn)生。已有越來越多的研究證明α7nAChR在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用,但是α7nAChR激活后的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路卻并未被研究透徹。α7nAChR激動(dòng)劑尼古丁和乙酰膽堿能夠抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放,但是卻不影響這些炎癥因子的mRNA水平,提示我們尼古丁的抑炎作用,發(fā)生于轉(zhuǎn)錄后水平。而我們知道m(xù)iRNA這樣一種內(nèi)源性的小分子非編碼RNA對(duì)靶mRNA的抑制作用也發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。因此我們?cè)O(shè)想:miRNAs可能在膽堿能抗炎中扮演了重要的角色,本課題的研究目的在于探討是否存在作用于膽堿能抗炎通路的miRNAs,并對(duì)其作用機(jī)制及加強(qiáng)膽堿能抗炎的療效進(jìn)行觀察。 研究方法: 本研究以內(nèi)毒素誘導(dǎo)炎癥為主要模型,在整體動(dòng)物和巨噬細(xì)胞模型上,利用整體動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和分子生物學(xué)手段,研究參與膽堿能抗炎過程的miRNAs (已經(jīng)篩選出miR-124a作為研究對(duì)象)。在細(xì)胞水平上,研究miR-124a對(duì)炎癥因子IL-6與TNF-α表達(dá)的影響;在動(dòng)物整體水平上,通過研究miR-124a過表達(dá)以及缺失情況下對(duì)炎性休克的影響,進(jìn)一步證實(shí)miR-124a的抗炎作用;并使用分子生物學(xué)手段初步探討miR-124a抗炎作用的機(jī)制。 結(jié)果: 1.在RAW264.7巨噬細(xì)胞建立尼古丁抗炎模型,發(fā)現(xiàn)尼古丁抗炎特點(diǎn)——降低IL-6蛋白水平與mRNA水平的表達(dá),僅降低TNF-α蛋白水平的表達(dá)卻不影響TNF-αmRNA水平的表達(dá);尼古丁激活α7nAChR后能夠明顯上調(diào)使miR-124a的表達(dá)量;通過時(shí)效實(shí)驗(yàn)我們觀察到,尼古丁作用后3h,miR-124a表達(dá)開始上調(diào),早于尼古丁對(duì)炎癥因子IL-6與TNF-α的抑制作用;而miR-124a過表達(dá)可以劑量依賴的降低IL-6與TNF-α的蛋白水平,也可劑量依賴的下調(diào)IL-6 mRNA水平,但是不影響TNF-α的mRNA水平,與尼古丁抗炎的特點(diǎn)相符;miR-124a knockdown后可以觀察到尼古丁對(duì)IL-6與TNF-α蛋白水平的抑制作用均有減弱,但是僅減弱尼古丁對(duì)IL-6 mRNA的抑制而不影響TNF-α的水平。 2.在動(dòng)物整體水平,我們摸索了內(nèi)毒素致Blab/c小鼠感染性休克的劑量與尼古丁的有效抗休克劑量;并觀察到尼古丁抗炎時(shí),小鼠心、脾、腦與血清中miR-124a的表達(dá)均有明顯的上調(diào);而在整體水平使miR-124a過表達(dá)可以顯著延長內(nèi)毒素血癥小鼠的生存時(shí)間;miR-124a整體水平knockdown后尼古丁抗休克作用減弱。 3.熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證明miR-124a不能直接作用于IL-6和TNF-ααmRNA的3’-UTR,但是可以直接作用于STAT3 mRNA的3’-UTR;在RAW細(xì)胞中miR-124a過表達(dá)能夠抑制STAT3蛋白表達(dá),而且能夠通過抑制STAT3蛋白表達(dá)而抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的STAT3磷酸化增加;通過觀察尼古丁對(duì)STAT3與p-STAT3蛋白表達(dá)時(shí)效影響,發(fā)現(xiàn)LPS作用3h后p-STAT3表達(dá)顯著上調(diào),而尼古丁能夠降低STAT3蛋白表達(dá)及其磷酸化,而不影響STAT3 mRNA的水平,說明尼古丁對(duì)STAT3的調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平;STAT3 knockdown使LPS誘導(dǎo)的IL-6的蛋白水平與mRNA的水平均被抑制,而對(duì)TNF-α蛋白水平和mRNA水平均無影響;STAT3 knockout細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)炎癥后IL-6蛋白和mRNA水平明顯降低,但上清TNF-α蛋白水平未能檢出。STAT3 knockdown后miR-124a抑制IL-6蛋白的作用減弱,而不影響TNF-α蛋白水平。 4.尼古丁可以降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α蛋白穩(wěn)定性,miR-124a mimics同樣能夠降低TNF-α蛋白穩(wěn)定性。 結(jié)論: 尼古丁激活α7nAChR后上調(diào)miR-124a的表達(dá),而miR-124a通過抑制STAT3的蛋白水平及其活化水平而減少IL-6 mRNA和蛋白的生成,miR-124a對(duì)TNF-α的抑制通過STAT3外的機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

炎癥是一種對(duì)于生存至關(guān)重要的基本生理過程，但同時(shí)它又是人類多種疾的主要誘因。在發(fā)達(dá)國家人口死亡原因中，膿毒癥（敗血病）位居第三心肌梗死的致死率相同。休克、腫瘤、缺血和重傷都可引發(fā)重癥膿血癥，促炎細(xì)胞因子(比如 TNF- ，IL-1，HMGB1) 的產(chǎn)生，從而引起器官損傷]。由于重癥膿毒癥不僅僅是由感染引起的，因此單純運(yùn)用抗生素并不能有癥。膽堿能抗炎通路是新近發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)一免疫調(diào)節(jié)通路，它的激活可以有效減炎因子的釋放，對(duì)全身和局部炎癥均具有明顯的抑制作用，，為調(diào)節(jié)細(xì)胞和炎癥反應(yīng)提供了潛在的有效途經(jīng)。它可以被看作是一種內(nèi)源性的神經(jīng)機(jī)制（圖 1）：當(dāng)中樞收到免疫刺激信息后，將信號(hào)投射到各迷走神經(jīng)核傳出迷走神經(jīng)纖維，引起外周神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿 ACh，激活細(xì)胞膜7 受體（ 7-nicotinic acetylcholine receptor, 7nAChR）[1-3]。

有利[4,5]。在龐大的抗炎網(wǎng)絡(luò)中，糖皮質(zhì)激素、抗炎因子和其他體液調(diào)節(jié)因子于濃度梯度緩慢地、分散地發(fā)揮作用，歷時(shí)數(shù)小時(shí)或數(shù)天。而神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)速的，在炎癥反應(yīng)的初始關(guān)鍵階段起著重要作用。由于神經(jīng)傳導(dǎo)具有不應(yīng)期，制生物功能是短暫的，如沒有進(jìn)一步的信號(hào)輸入，免疫細(xì)胞就能快速恢復(fù)功所以與體液抗炎通路相比，神經(jīng)抗炎通路反應(yīng)相對(duì)更快、更局限化。免疫細(xì)胞膜上 7nAChR 的激活，可以有效減少多種致炎細(xì)胞因子的釋放，從制炎癥反應(yīng)程度，發(fā)揮抗炎癥損傷、抗感染和抗休克作用。但是 7nAChR 活的下游機(jī)制并未研究透徹，可能與激活 JAK2-STAT3 通路以及抑制 NF- B 通關(guān)[1,6]。有意思的是，膽堿能抗炎通路雖然降低炎癥因子 TNF- 、IL-6 等炎癥的蛋白表達(dá)，但并不降低其 mRNA 水平，說明是一種轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)（圖[1]。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 崔蓉;黃芩和黃連對(duì)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用及其與膽堿能抗炎通路的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2562931