【摘要】：目的： 為彌補(bǔ)用單克隆抗體制備D-二聚體抗體方法的不足,尋找高特異性D-二聚體抗原決定簇,本課題通過(guò)制備人源性D-二聚體粗品用來(lái)免疫小鼠,獲得其抗體cDNA,為下一步D-二聚體噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩庫(kù)打下基礎(chǔ)。 方法： 采用凍融法從新鮮人血漿中提取纖維蛋白原。將人纖維蛋白原溶液與正常人新鮮血漿(提供制備交聯(lián)纖維蛋白的凝血酶與ⅩⅢ因子)混合并加入咪唑緩沖液(IBS)制備得人交聯(lián)纖維蛋白,再經(jīng)人纖維蛋白溶解酶水解。產(chǎn)物通過(guò)交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex) G-150凝膠過(guò)濾制備獲得D-二聚體的粗品。經(jīng)過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)蛋白純度后,加入等體積完全福氏佐劑用于免疫BALB/C小鼠。再每隔一周用D-二聚體的粗品與等體積的福氏不完全佐劑混合加強(qiáng)免疫共3次后取脾、低溫碾磨、勻漿,提取脾臟細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 結(jié)果： 1.采用凍融法從新鮮人血漿中提取的纖維蛋白原沉淀,經(jīng)咪唑緩沖液溶解后加入新鮮人血漿,37℃水浴10分鐘纖維蛋白原完全凝固成白色膠體狀。經(jīng)尿素溶解實(shí)驗(yàn)確定為交聯(lián)纖維蛋白膠體。 2.將交聯(lián)纖維蛋白膠體置于pH7.6的TBS緩沖液中,加入纖維蛋白溶解酶。經(jīng)過(guò)37℃搖床水解48小時(shí),交聯(lián)纖維蛋白膠體基本完全降解為可溶性降解產(chǎn)物。溶液經(jīng)冷干78小時(shí)后轉(zhuǎn)為微黃色完全溶解液體。 3.獲取的液體經(jīng)非還原性SDS-PAGE,考馬斯亮藍(lán)R250染色,脫色顯色后顯示出幾條清晰的條帶。按照蛋白質(zhì)Marker的分子量對(duì)照,可以認(rèn)為獲取液所含大部分蛋白質(zhì)約為190KDa。與D-二聚體的分子量大小一致,說(shuō)明酶解條件合適。 4.獲取液再以每小時(shí)10m1的速度,用pH7.6的TBS緩沖液平衡,上樣,凝膠過(guò)濾。每10分鐘獲取一次濾過(guò)液,收集完后透析,去鹽,再進(jìn)行SDS-PAGE,顯示經(jīng)β-巰基乙醇還原后出現(xiàn)90、80KDa的蛋白質(zhì)碎片,應(yīng)為D-二聚體的D碎片及β-鏈。 5.取得的D-二聚體粗品經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾除菌免疫小鼠,四周后提取小鼠脾臟細(xì)胞總RNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),提取的總RNA三條帶兩條清晰可見(jiàn),符合逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)論： 本課題從新鮮人血漿中提取纖維蛋白原,制備形成人交聯(lián)纖維蛋白膠體,通過(guò)蛋白酶降解、凝膠過(guò)濾后分離提純、免疫小鼠提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。后期課題可運(yùn)用RT-PCR技術(shù)獲得抗D-二聚體抗體可變區(qū)VL、VH的基因,構(gòu)建噬菌體D-二聚體抗體文庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)成功的分離提純了D-二聚體粗品,為免疫小鼠提供了抗原。為成功構(gòu)建全套抗D-二聚體噬菌體抗體庫(kù)打下了基礎(chǔ)。同時(shí)也為人血漿蛋白分離提純提供了相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 韓東剛;段小藝;郭佑民;周琦;王全穎;楊廣笑;;抗表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與初步篩選[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年01期

2 李敏康;錢(qián)冬明;;凍融法提取豬血纖維蛋白原[J];分析試驗(yàn)室;2007年04期

3 劉生杰;周楊;朱茂英;聶傳鵬;李東偉;余為一;;辛酸沉淀-凝膠過(guò)濾法提取豬血清IgM[J];阜陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年04期

4 許元生,熊冬生,肖瑛,范冬梅,王金宏,楊純正;疏水層析法和凝膠過(guò)濾法分離HI47抗CD20F(ab’)_2之比較[J];免疫學(xué)雜志;2005年02期

5 周育,秦華夏,徐勁松,黃儀秀,朱圣庚;水蛭素在噬菌體表面的展示[J];生物工程學(xué)報(bào);1999年01期

6 歐陽(yáng)偉民,余瑞元,徐長(zhǎng)法;尿激酶抗人交聯(lián)纖維蛋白-D-二聚體單抗化學(xué)偶合體的制備[J];生物化學(xué)雜志;1997年04期

7 陳風(fēng),陳軍,羅秋玲,黃未來(lái);Von Clauss法中緩沖液的自制與應(yīng)用[J];現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2004年02期

8 鄭玉姝;趙樸;趙宏坤;;SDS-PAGE染色-脫色方法的改良[J];實(shí)驗(yàn)室研究與探索;2007年01期

9 汪樺;薛小平;雷迎峰;宋凱;呼延霆;王偉;楊慧;;鼠源性抗人HAAH mAb可變區(qū)基因克隆及單鏈抗體的構(gòu)建和表達(dá)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年05期

10 王琰,王雅明,劉群英,徐建軍,李全喜,陳宇萍,王力民,李競(jìng);從噬菌體抗體庫(kù)克隆抗人RBC單鏈抗體基因[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1998年01期

，

本文編號(hào)：2562901