【摘要】：目的： 為彌補用單克隆抗體制備D-二聚體抗體方法的不足,尋找高特異性D-二聚體抗原決定簇,本課題通過制備人源性D-二聚體粗品用來免疫小鼠,獲得其抗體cDNA,為下一步D-二聚體噬菌體抗體庫的構建與篩庫打下基礎。 方法： 采用凍融法從新鮮人血漿中提取纖維蛋白原。將人纖維蛋白原溶液與正常人新鮮血漿(提供制備交聯(lián)纖維蛋白的凝血酶與ⅩⅢ因子)混合并加入咪唑緩沖液(IBS)制備得人交聯(lián)纖維蛋白,再經(jīng)人纖維蛋白溶解酶水解。產(chǎn)物通過交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex) G-150凝膠過濾制備獲得D-二聚體的粗品。經(jīng)過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測蛋白純度后,加入等體積完全福氏佐劑用于免疫BALB/C小鼠。再每隔一周用D-二聚體的粗品與等體積的福氏不完全佐劑混合加強免疫共3次后取脾、低溫碾磨、勻漿,提取脾臟細胞總RNA,逆轉錄為cDNA。 結果： 1.采用凍融法從新鮮人血漿中提取的纖維蛋白原沉淀,經(jīng)咪唑緩沖液溶解后加入新鮮人血漿,37℃水浴10分鐘纖維蛋白原完全凝固成白色膠體狀。經(jīng)尿素溶解實驗確定為交聯(lián)纖維蛋白膠體。 2.將交聯(lián)纖維蛋白膠體置于pH7.6的TBS緩沖液中,加入纖維蛋白溶解酶。經(jīng)過37℃搖床水解48小時,交聯(lián)纖維蛋白膠體基本完全降解為可溶性降解產(chǎn)物。溶液經(jīng)冷干78小時后轉為微黃色完全溶解液體。 3.獲取的液體經(jīng)非還原性SDS-PAGE,考馬斯亮藍R250染色,脫色顯色后顯示出幾條清晰的條帶。按照蛋白質Marker的分子量對照,可以認為獲取液所含大部分蛋白質約為190KDa。與D-二聚體的分子量大小一致,說明酶解條件合適。 4.獲取液再以每小時10m1的速度,用pH7.6的TBS緩沖液平衡,上樣,凝膠過濾。每10分鐘獲取一次濾過液,收集完后透析,去鹽,再進行SDS-PAGE,顯示經(jīng)β-巰基乙醇還原后出現(xiàn)90、80KDa的蛋白質碎片,應為D-二聚體的D碎片及β-鏈。 5.取得的D-二聚體粗品經(jīng)微孔濾膜過濾除菌免疫小鼠,四周后提取小鼠脾臟細胞總RNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,提取的總RNA三條帶兩條清晰可見,符合逆轉錄為cDNA的標準。 結論： 本課題從新鮮人血漿中提取纖維蛋白原,制備形成人交聯(lián)纖維蛋白膠體,通過蛋白酶降解、凝膠過濾后分離提純、免疫小鼠提取總RNA,逆轉錄形成cDNA。后期課題可運用RT-PCR技術獲得抗D-二聚體抗體可變區(qū)VL、VH的基因,構建噬菌體D-二聚體抗體文庫。本實驗成功的分離提純了D-二聚體粗品,為免疫小鼠提供了抗原。為成功構建全套抗D-二聚體噬菌體抗體庫打下了基礎。同時也為人血漿蛋白分離提純提供了相關經(jīng)驗。
【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R346

【參考文獻】

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本文編號：2562901