【摘要】：目的: 1.探索SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)的分離、培養(yǎng)方法； 2.證明ADMSCs在5－氮雜胞苷(5-Aza)誘導(dǎo)下可分化為心肌細(xì)胞； 3.探討ADMSCs細(xì)胞在向心肌細(xì)胞分化過程中miRNA的變化譜。 方法： 1.SD大鼠ADMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定：無菌條件下取SD大鼠腹股溝皮下脂肪組織，采用胰酶加I型膠原酶消化法及貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察；取第3代細(xì)胞進(jìn)行表面抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定； 2.ADMSCs的體外誘導(dǎo)及鑒定：對(duì)第3代細(xì)胞行5-Aza誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，進(jìn)行α-actin及cTnT免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。 3.測定培養(yǎng)ADMSCs向心肌細(xì)胞分化過程中miRNA的變化譜：細(xì)胞分為三組，第一組為第三代ADMSCs，第二組為同期培養(yǎng)未經(jīng)誘導(dǎo)的ADMSCs，第三組為經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)后培養(yǎng)四周的細(xì)胞。應(yīng)用miRNA生物傳感器陣列（miRNAA-SensorArray）方法分別檢測以上三組細(xì)胞的miRNA譜，比較之間的差異。 結(jié)果： 1.脂肪組織中含有大量長梭形細(xì)胞，成螺旋形生長，免疫化學(xué)鑒定顯示與空白對(duì)照相比較細(xì)胞表面分子抗原CD13、CD44、CD105呈陽性反應(yīng)，CD34、CD45、HLA-DR和Ⅷ因子均為陰性反應(yīng)。 2.10umol/L的5-Aza誘導(dǎo)24小時(shí)后更換含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，多數(shù)細(xì)胞為長梭形，部分細(xì)胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則星狀或桿狀，細(xì)胞體積及胞核變大，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)。與空白對(duì)照比較28d后多數(shù)細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示α-actin、cTnT呈陽性反應(yīng)。 3.應(yīng)用miRNA生物傳感器陣列（miRNAA-SensorArray）方法分別檢測三組細(xì)胞123種miRNA活性，第三代ADMSCs中miRNA活性值RIF不小于5的共有35種。發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后細(xì)胞的所有miRNA活性均有所上升。活性上升最為明顯的15種miRNA順序?yàn)椋簂et-7a，let-7b，let-7e，let-7f，let-7g，miR-125a-5p，miR-142-5p，miR-143，miR-145，miR-21，miR-222，miR-34c-5p，miR-92a。 結(jié)論： 1.出生三天的SD大鼠脂肪組織中含有具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.10umol/L濃度的5-Aza可誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞。 3.miRNA生物傳感器陣列方法同時(shí)大批量連續(xù)檢測多種miRNA活性，利于miRNA活性譜的連續(xù)監(jiān)測。 4.多種miRNA可能在細(xì)胞分化過程中起到重要作用，其中發(fā)揮最重要作用的miRNA可能是let7家族和miR-21。
【圖文】：

軍 醫(yī)進(jìn) 修學(xué) 院 碩 士學(xué) 位論 文分類 似 成 纖維 細(xì) 胞 樣 ，少 數(shù) 呈 多 角形 ， 部 分有 粗 大 突 起。 細(xì) 胞 核多 居 中， 常 見 1 ～ 2個(gè) 核 仁。 4 8 h 后 ， 貼 壁 的 細(xì)胞 開始 逐 漸分 裂增 殖 ，伸 展 變大 ， 約 3 ～5 d 后 ， 多 能 80 % 左右 融 合 成單 層 細(xì) 胞 ，可 進(jìn) 行 傳代 培 養(yǎng) 。傳 代 后 的 細(xì)胞 生 長 速度 明 顯 快 于原 代 細(xì) 胞， 約3 ～ 4天 傳 代 一次 。 經(jīng) 3 ～4 次 連 續(xù)傳 代 后， 細(xì)胞 多 變 為 均一 的 梭 形 ，排 列 更 加整 齊 有序 ， 部分 呈 螺旋 巢 狀分 布 ， 雜質(zhì) 細(xì) 胞明 顯 減少 。

軍 醫(yī)進(jìn) 修學(xué) 院 碩 士學(xué) 位論 文如 圖 1 -5 所 示， 起 始 每孔 接 種細(xì) 胞 數(shù) 個(gè)數(shù) 為 2. 0 × 10 4， 第 4 代 與 第 7 代 間胞生 長 曲 線基 本 吻 合 。由 此 說 明： 不 同 代細(xì) 胞 的 生 長曲 線 可 重復(fù) 性 好 ， 細(xì)胞 可 持良 好 并 且均 一 一致 的 生 長速 度 。 （三 ） AD M S Cs 凍存 與 復(fù)蘇 對(duì) 存活 率 的 影響 ： AD M S C s 凍存 4 周后 ， 3 7℃ 水 浴 快 速復(fù) 蘇 ， 臺(tái) 盼藍(lán) 拒 染 法檢 測 細(xì) 胞 存活 率 90 % 以 上 。 不 同傳 代 細(xì)胞 凍 存和 復(fù) 蘇 后， 存 活率 差 異 不大 。 （四 ） 細(xì)胞 表 面標(biāo) 記 鑒定 ： 第 3 ～ 6 代 細(xì) 胞 表 面 分 子 C D1 3 、 C D4 4 、 C D1 05 均 陽 性 表 達(dá) ，， 其 中 C D1 3 子染 色最 強(qiáng) （ 圖 1 -6 ～ 1- 8 ）；C D4 5 、H L A -D R 、Ⅷ 、 V W F 因子 均陰 性 。復(fù) 蘇后 胞表 面 標(biāo)記 物 C D1 3 、 C D4 4 、 C D1 0 5 保持 陽性 。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張端珍,蓋魯粵,劉宏偉,朱鮮陽;脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞研究[J];心臟雜志;2005年05期

本文編號(hào)：2560739