【摘要】：目的:研究Ca~(2+)感受蛋白[基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)與鈣釋放激活鈣通道蛋白1(Orai1)]在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)鈣敏感受體(Ca SR)介導(dǎo)的鈣內(nèi)流和一氧化氮(NO)生成中的相互作用。方法:將Ca SR激動(dòng)劑精胺[鈣池操縱性鈣通道(SOC)和受體操縱性鈣通道(ROC)均激活]單用或與ROC模擬劑12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)+Ca SR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex 231(激活ROC、阻斷SOC)、蛋白激酶C(PKC)抑制劑Ro 31-8220和PKCα/β1選擇性抑制劑Go 6976(激活SOC、阻斷ROC)聯(lián)合孵育HUVECs;利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)HUVECs中STIM1和Orai1的蛋白表達(dá)和共定位;免疫共沉淀法檢測(cè)STIM1和Orai1之間的相互作用;取2~3代HUVECs隨機(jī)分為特異性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(sh STIM1+sh Orai1組)、空質(zhì)粒組(vehicle-STIM1+vehicle-Orai1組)和未轉(zhuǎn)染組(control組),將3組細(xì)胞分別加入上述4組不同藥物刺激,采用熒光探針Fura-2/AM檢測(cè)HUVECs中Ca~(2+)濃度的變化,NO熒光探針DAF-FM DA負(fù)載方法同步檢測(cè)HUVECs中NO生成的變化。結(jié)果:STIM1和Orai1蛋白表達(dá)共定位于胞漿,與control組相比,加入Calhex 231+TPA、Ro 31-8220和Go 6976刺激后,STIM1和Orai1在胞漿中的定位均減少,且二者的相互作用均減弱;在4種不同處理因素作用下,sh STIM1+sh Orai1組細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度和NO凈熒光強(qiáng)度均明顯降低(P0.05)。結(jié)論:STIM1與Orai1以二元復(fù)合物的形式共同調(diào)節(jié)Ca SR,并通過(guò)激活SOC和ROC介導(dǎo)鈣內(nèi)流及NO生成。

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