【摘要】：骨骼肌組織工程的建立為各種骨骼肌疾病(肌營(yíng)養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮等)提供了治療希望,也使整形外科治療創(chuàng)傷、腫瘤切除、失神經(jīng)支配所致的肌組織缺失進(jìn)行外科重建成為可能[1,2],許多學(xué)者致力于骨骼肌的體外構(gòu)建和替代研究,試圖創(chuàng)建功能化的肌組織。經(jīng)過(guò)多年的探索和努力,一些權(quán)威的研究組取得了相當(dāng)?shù)某煽?jī),不斷推進(jìn)骨骼肌組織工程的研究進(jìn)展：Powell等采用膠原和基質(zhì)成功構(gòu)建三維骨骼肌組織,并對(duì)構(gòu)建組織施加機(jī)械剌激,確保體外培養(yǎng)肌組織的形成、分化和收縮功能形成；Dennis和Kosnik則探索出三維骨骼肌組織的自組裝模式,作者稱其構(gòu)建肌組織為Myooids,在橫向電刺激時(shí)具有持續(xù)的興奮性和收縮功能。德國(guó)的Bach研究組進(jìn)行了成肌細(xì)胞與纖維蛋白三維支架的復(fù)合培養(yǎng),獲得了具有極性分化功能的多核肌管[7,8]。然而,體外條件下進(jìn)行骨骼肌組織的構(gòu)建仍面對(duì)諸多挑戰(zhàn),尤其在神經(jīng)化方面。在體研究肌肉的神經(jīng)支配十分困難,目前研究人員一般采用將成肌細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞體外共培養(yǎng)來(lái)研究成肌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞的相互作用,并取得了一系列進(jìn)展。比較經(jīng)典的是從動(dòng)物胚胎的脊髓獲取神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行純化,然后共培養(yǎng)。Wagner共培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞和胚胎大鼠脊髓,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組的分化肌管表達(dá)更高密度的乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor, AchRs),肌管具有更強(qiáng)的導(dǎo)電能力。Das[10]等將大鼠的神經(jīng)細(xì)胞和肌細(xì)胞直接聯(lián)合培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)兩者之間形成了神經(jīng)肌肉接頭。神經(jīng)末梢及各種神經(jīng)遞質(zhì)的缺乏不利于分化肌管的長(zhǎng)期存活和收縮功能的維持,在體外條件下成肌細(xì)胞與外周神經(jīng)元的相關(guān)性是構(gòu)建神經(jīng)化骨骼肌組織的關(guān)鍵因素。上述研究明確了神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)成肌干細(xì)胞的生物學(xué)影響,但由于原代分離培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)體外生存環(huán)境要求較高,體外成肌細(xì)胞的存活、增殖及分化環(huán)境很難同時(shí)滿足原代分離神經(jīng)元的生長(zhǎng)要求,為體外骨骼肌組織工程構(gòu)建的開(kāi)展帶來(lái)一定困難。 PC12細(xì)胞是褐家鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系起源于神經(jīng)嵴,易獲得,便于體外培養(yǎng),細(xì)胞增殖能力強(qiáng),表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)受體TrkA和p75NTR,因此NGF能與其受體結(jié)合使ras/raf/MEK/ERK信號(hào)通路活化[11-13],使其停止增殖,細(xì)胞表型發(fā)生明顯改變,獲得神經(jīng)元特性,如長(zhǎng)出細(xì)胞突起、形成突觸樣結(jié)構(gòu)、具有電興奮特性等。PC12細(xì)胞未分化時(shí)合成兒茶酚胺,在NGF的作用下可以合成乙酰膽堿并且長(zhǎng)出神經(jīng)突結(jié)構(gòu)[14]。廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。周濤[15]等的研究表明,PC12細(xì)胞能與原代神經(jīng)元之間形成突觸連接,JEON[16]等發(fā)現(xiàn)NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞之間可以形成突觸樣結(jié)構(gòu)。王靜[17]等將誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞可作為體外再造心肌神經(jīng)支配研究模型的供體細(xì)胞。Glass[18]等的研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌纖維與PC12細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),肌肉細(xì)胞中的慢肌球蛋白輕鏈2的合成水平增高。Defez[19]等也證實(shí)了PC12細(xì)胞可以影響骨骼肌的分化進(jìn)程。有關(guān)PC12細(xì)胞與C2C12細(xì)胞的體外共培養(yǎng)及相互的功能影響,目前尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。 鑒于上述研究背景,本研究嘗試將已經(jīng)分化的PC12細(xì)胞與成肌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),觀察其對(duì)成肌細(xì)胞是否具有支配關(guān)系,為構(gòu)建組織工程骨骼肌提供一種新的方法和思路。 [目的] 用NGF對(duì)PC12細(xì)胞的誘導(dǎo)分化,通過(guò)免疫熒光染色觀察NGF對(duì)PC12細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。 [方法] PC12細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后用含100U/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基,種植于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)將培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞按2×104/mL密度接種于預(yù)先置有小蓋玻片的6孔板中,待細(xì)胞達(dá)到80-90%后,加入濃度為50ug/L NGF的DMEM/F12培養(yǎng)基對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng),1d換液,相差顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài)。分別在分化3d和7d后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。 [結(jié)果] 未分化的PC12細(xì)胞呈圓形、短梭形或三角形,有的細(xì)胞兩端有突起伸出,有的較長(zhǎng),其上還有小的突起,類似神經(jīng)元軸突。換含有NGF的培養(yǎng)液后,細(xì)胞伸出多條樹(shù)突狀突起,長(zhǎng)短不一,突起數(shù)目不等。神經(jīng)元突起細(xì)長(zhǎng),大體形態(tài)與成熟神經(jīng)元相似。培養(yǎng)72h后,細(xì)胞之間相互連接交織成網(wǎng)狀。繼續(xù)培養(yǎng)至第7d,細(xì)胞進(jìn)一步分化。[結(jié)論] 細(xì)胞之間相互連接交織成網(wǎng)狀,說(shuō)明NGF具有促進(jìn)PC12細(xì)胞分化的作用,神經(jīng)元細(xì)胞微管相關(guān)蛋白-2(microtubule associated protein-2,MAP-2)是神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物,主要存在于神經(jīng)元的胞體和樹(shù)突中,可作為神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白PC12細(xì)胞免疫熒光MAP-2陽(yáng)性表達(dá)表明在NGF的誘導(dǎo)下,PC12細(xì)胞已經(jīng)分化為較成熟的神經(jīng)元細(xì)胞。 [目的] 建立PC12細(xì)胞和C2C12細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)體系,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)C2C12細(xì)胞周期,研究PC12細(xì)胞是否干擾C2C12細(xì)胞的體外增殖。[方法] 細(xì)胞培養(yǎng)分組：(1)空白對(duì)照組：C2C12細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)；(2)實(shí)驗(yàn)組：C2C12細(xì)胞與已分化的PC12細(xì)胞共培養(yǎng)；(3)陰性對(duì)照組：C2C12細(xì)胞與未分化的PC12細(xì)胞共培養(yǎng)；以上共培養(yǎng)組均為T(mén)ranswell小室內(nèi)接種PC12細(xì)胞,六孔板內(nèi)接種C2C12細(xì)胞,細(xì)胞濃度為(1.0-1.2)×108/L的C2C12細(xì)胞懸液,待細(xì)胞貼壁后,將已接種PC12的Transwell小室(孔徑為0.4μm)放入六孔板進(jìn)行共培養(yǎng),二者接種細(xì)胞的比例為1：1,24h后按不同的分組情況更換培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組加入濃度為50ug/L NGF的DMEM/F12培養(yǎng)基對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行分化培養(yǎng),空白對(duì)照組培養(yǎng)基同實(shí)驗(yàn)組,陰性對(duì)照組換原有培養(yǎng)基,常規(guī)CO2培養(yǎng)箱孵育。另外將C2C12細(xì)胞接種到處理好的玻片上,分組及換液同上所述。共培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)。同時(shí)對(duì)玻片上的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光蛋白檢測(cè)。流式結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 3組細(xì)胞增殖培養(yǎng)48h后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測(cè)儀檢測(cè)每組3個(gè)樣本細(xì)胞的分裂增殖周期,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示不同組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.00,P0.05),LSD檢驗(yàn)兩兩比較顯示實(shí)驗(yàn)組與其他兩組之間DNA合成前期細(xì)胞所占百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),反應(yīng)增殖活力的增殖指數(shù)PrI(包括DNA合成期、DNA合成后期和有絲分裂期)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí)MyoD蛋白免疫熒光檢測(cè)的陽(yáng)性表達(dá)表明C2C12處于增殖時(shí)期,進(jìn)一步說(shuō)明已分化的PC12細(xì)胞抑制C2C12細(xì)胞的增殖。 [結(jié)論] 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)已分化的PC12細(xì)胞抑制C2C12細(xì)胞的增殖,為進(jìn)一步構(gòu)建神經(jīng)化肌組織提供的一個(gè)新思路。 [目的] 建立PC12細(xì)胞和C2C12細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng),通過(guò)RT-PCR、qPCR及免疫熒光檢測(cè)C2C12細(xì)胞Myogenin、Desmin基因及蛋白的表達(dá),分析PC12細(xì)胞細(xì)胞能否對(duì)C2C12細(xì)胞分化產(chǎn)生影響。 [方法] 細(xì)胞培養(yǎng)分組：(1)空白對(duì)照組：C2C12細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)；(2)實(shí)驗(yàn)組：C2C12細(xì)胞與已分化的PC12細(xì)胞共培養(yǎng)；(3)陰性對(duì)照組：C2C12細(xì)胞與未分化的PC12細(xì)胞共培養(yǎng)；以上共培養(yǎng)組均為T(mén)ranswell小室內(nèi)接種PC12細(xì)胞,六孔板內(nèi)接種C2C12細(xì)胞,細(xì)胞濃度為(1.0-1.2)×108/L的C2C12細(xì)胞懸液,待細(xì)胞貼壁后,將已接種PC12的Transwell小室(孔徑為0.4gm)放入六孔板進(jìn)行共培養(yǎng),二者接種細(xì)胞的比例為1：1,24h后按不同的分組情況更換培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組加入濃度為50ug/L NGF的DMEM/F12培養(yǎng)基對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行分化培養(yǎng),空白對(duì)照組培養(yǎng)基同實(shí)驗(yàn)組,陰性對(duì)照組換原有培養(yǎng)基,常規(guī)CO2培養(yǎng)箱孵育。分別于第3、7d收集3組C2C12細(xì)胞,用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,用Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,經(jīng)特定引物PCR擴(kuò)增。免疫熒光檢測(cè)共培養(yǎng)7dMyogenin、 Desmin特異蛋白的表達(dá)。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 采用RT-PCR和qPCR對(duì)培養(yǎng)3、7d后所獲取的C2C12進(jìn)行檢測(cè),可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組Myogenin、Desmin基因的表達(dá)均高于同一培養(yǎng)時(shí)間其他培養(yǎng)組,3d和7d時(shí)采用單因素方差分析顯示不同組Myogenin基因的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=185.153,P0.05和F=6020.343,P0.05),不同組Desmin基因的表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2149.081,P0.05和F=57.612,P0.05),Myogenin、Desmin特異性蛋白檢測(cè)顯示,實(shí)驗(yàn)組熒光蛋白的表達(dá)更密集。表明已分化的PC12細(xì)胞促進(jìn)C2C12細(xì)胞的分化。 [結(jié)論] RT-PCR, qPCR及免疫熒光結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組成肌分化基因Myogenin、Desmin的表達(dá)均明顯高于其他培養(yǎng)組。已分化PC12細(xì)胞促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

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8 朱登納;賈延R，

本文編號(hào)：2559658