本文關鍵詞：線粒體DNA缺失對ox-LDL誘導巨噬細胞焦亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景及目的:線粒體DNA缺失細胞(rho0細胞)是指細胞內(nèi)不含有線粒體DNA,同時喪失線粒體功能,無法進行氧化呼吸而僅依靠糖酵解供能存活的一類細胞。目前rho0細胞的培養(yǎng)方法主要有溴化乙錠誘導法和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染誘導。通過制備rho0細胞,可以對線粒體的一些重要功能,如ROS的產(chǎn)生,氧化磷酸化,ATP產(chǎn)生,電子鏈的傳遞等進行研究。細胞焦亡的發(fā)現(xiàn)來自早期研究胞內(nèi)寄生菌對巨噬細胞作用機制。這種caspase-1依賴的細胞死亡方式不是單核巨噬細胞系所特有的,在樹突狀細胞及其他細胞中均有細胞焦亡的相關報導。各種刺激因素均能夠誘導細胞發(fā)生焦亡,這其中不僅包括病原微生物的病原相關分子模式(PAMP),還包括來自機體自身的損傷相關分子模式(DAMP)。近期文獻報導,動脈粥樣硬化組織樣本的免疫組化顯示,活化的caspase-1在晚期粥樣斑塊中大量表達,同時與巨噬細胞存在共定位關系。體外實驗結(jié)果表明,ox-LDL可以通過激活caspase-1分子誘導的巨噬細胞發(fā)生細胞膜溶解性死亡,并伴隨有大量IL-1β和IL-18等細胞因子的釋放。基因敲除實驗進一步提示,CD36分子及NLRP3炎癥體亦參與在此過程中。線粒體功能失常可以影響細胞對凋亡途徑的調(diào)控,在線粒體DNA缺失的多種細胞系中,都表現(xiàn)出對凋亡的抵抗性。但是線粒體及線粒體DNA缺失在ox-LDL誘導的巨噬細胞焦亡中的作用及發(fā)生機制,目前尚不清楚。本研究擬通過制備線粒體DNA缺失的巨噬細胞,進一步探討線粒體在ox-LDL誘導的巨噬細胞焦亡中的作用及機制,為深入研究線粒體在炎癥體活化調(diào)控及其在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用打下基礎并提供新的思路。方法:采用含溴化乙錠的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)J774A.1巨噬細胞90d后,采用倒置相差顯微鏡,觀察J774A.1 rho0細胞形態(tài);使用CCK8法檢測細胞在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中增殖能力;用PCR擴增法觀察線粒體編碼的細胞色素C氧化酶1(cytochrome c oxidase 1,Mt COI)DNA水平與細胞核編碼的18S核糖體RNA(18S r RNA)的DNA之比;采用SYBR Green染色法,觀察J774A.1 rho0細胞胞內(nèi)核酸;采用油紅O染色觀察ox-LDL處理后的巨噬細胞內(nèi)脂滴的聚集情況;采用COD-PAP法檢測ox-LDL處理后的巨噬細胞內(nèi)總膽固醇水平;采用AO/EB染色及LDH釋放實驗觀察ox-LDL對細胞膜完整性的影響;Western blot檢測caspase-1及IL-1β的表達;采用DCFH-DA染色,在流式細胞儀上檢測ox-LDL處理前后的J774A.1 rho0細胞和J774A.1細胞的胞內(nèi)ROS產(chǎn)生;采用Mitotracker Green,Mitotracker Deep Red及DAPI染色,通過激光共聚焦顯微鏡檢測ox-LDL處理前后的J774A.1 rho0細胞和J774A.1細胞的線粒體膜電位變化。結(jié)果:倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果表明,J774A.1 rho0細胞與J774A.1細胞相比具有明顯形態(tài)學差異;CCK8法檢測結(jié)果表明在不含丙酮酸及尿嘧啶的DMEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng),J774A.1 rho0細胞的增殖受到明顯抑制;溴化乙錠可抑制線粒體DNA的復制,PCR結(jié)果顯示J774A.1 rho0細胞線粒體編碼的Mt COI DNA水平與細胞核編碼的18S r RNA的DNA比值遠小于J774A.1細胞;SYBR Green染色結(jié)果進一步表明J774A.1 rho0細胞胞質(zhì)的核酸量明顯少于J774A.1細胞;油紅O染色及COD-PAP法檢測結(jié)果表明線粒體DNA缺失不影響J774A.1 rho0細胞對ox-LDL的攝取及膽固醇在細胞內(nèi)的聚集;在50、100μg/ml ox-LDL分別處理J774A.1 rho0細胞及J774A.1細胞24 h后,J774A.1 rho0細胞組LDH釋放分別為(27.48±3.61)%,(40.94±3.92)%,明顯低于J774A.1細胞組(42.76±6.81)%,(67.3±8.05)%;AO/EB染色的結(jié)果顯示,在50、100μg/ml ox-LDL作用24 h后,視野中橘紅色信號所占比例J774A.1 rho0細胞組分別為(23±5.72)%,(28±11.78)%,明顯低于J774A.1細胞組(45±19.03)%,(81±13.83)%;Western blot檢測結(jié)果表明ox-LDL誘導J774A.1 rho0細胞caspase-1及IL-1β的表達水平明顯小于J774A.1細胞;應用DCFH-D染色,流式細胞儀檢測結(jié)果顯示J774A.1 rho0細胞經(jīng)過ox-LDL處理后,ROS生成為(58.7±0.84)%小于J774A.1細胞(91.6±0.61)%;激光共聚焦顯微鏡結(jié)果表明J774A.1 rho0細胞能夠抵抗ox-LDL誘導的線粒體膜電位的下降。結(jié)論:1.線粒體DNA缺失的J774A.1細胞可以減少ox-LDL誘導的caspase-1及IL-1β蛋白水平表達,細胞LDH釋放,表明線粒體DNA缺失能夠抵抗ox-LDL誘導的巨噬細胞焦亡。2.線粒體DNA缺失的J774A.1細胞并不影響巨噬細胞攝取ox-LDL及胞內(nèi)膽固醇的聚集。3.進一步驗證線粒體DNA缺失能夠抵抗ox-LDL誘導巨噬細胞焦亡的機制:線粒體DNA缺失可以導致細胞呼吸鏈被破壞,進而減少ROS的產(chǎn)生,從而抵抗ox-LDL誘導的巨噬細胞焦亡。同時J774A.1 rho0細胞能夠抵抗ox-LDL誘導的線粒體膜電位的下降。
【關鍵詞】：巨噬細胞 rho0 細胞 焦亡 ox-LDL ROS
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 引言14-16
• 實驗設計及流程16-17
• 實驗材料17-23
• 實驗方法23-30
• 結(jié)果30-43
• 討論43-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻46-50
• 附錄50-51
• 致謝51-52
• 綜述52-66
• 參考文獻62-66

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本文編號：255863