【摘要】：第一部分大鼠miR-145慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 目的：構(gòu)建針對(duì)rno-miR-145的慢病毒表達(dá)載體并鑒定其在血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）中是否過(guò)表達(dá)。 方法：人工合成含有酶切位點(diǎn)粘端miR-145 shDNA雙鏈模板序列，克隆于LV3pGLV/H1/GFP+Puro-miRNA慢病毒穿梭載體中,轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,收獲并濃縮慢病毒顆粒，同時(shí)構(gòu)建無(wú)關(guān)序列陰性對(duì)照載體（Scramble-NC）。采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠原代VSMC，并將細(xì)胞分為3組：正常對(duì)照組、miR-145組、miR-NC組。倒置熒光顯微鏡下觀察VSMC感染后的熒光表達(dá)情況,Real-time PCR檢測(cè)各組miR-145的表達(dá)情況。 結(jié)果：（1）成功構(gòu)建了miR-145慢病毒載體，測(cè)定病毒滴度為1×109TU/ml。（2）倒置熒光顯微鏡下觀察大鼠microRNA-145慢病毒表達(dá)載體感染成功，MOI值為50，感染72h時(shí)感染率最高。（3）Real-time PCR結(jié)果顯示構(gòu)建的miR-145過(guò)表達(dá)慢病毒載體在感染目的細(xì)胞72小時(shí)后較空白細(xì)胞或陰性對(duì)照細(xì)胞表達(dá)豐度增加72.50倍(P0.01)。 結(jié)論：（1）建立了高效穩(wěn)定表達(dá)rno-miR-145的慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（2）miR-145慢病毒載體感染VSMC后可高效的過(guò)表達(dá)，從而為進(jìn)步研究miR-145在大鼠VSMC中的作用提供理論依據(jù)。 第二部分miR-145對(duì)VSMC表型轉(zhuǎn)化及增殖的影響 目的：miR-145慢病毒載體感染大鼠原代VSMC,PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化及增殖，選擇3個(gè)VSMC表型標(biāo)志基因PCNA、c-Jun及SM22a，觀察miR-145對(duì)VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖是否有抑制作用。 方法：采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠原代VSMC，加入PDGF（10ng/ml）誘導(dǎo)VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，使VSMC轉(zhuǎn)化為去分化型（即獲得增殖能力），，并將細(xì)胞分為4組：正常對(duì)照組、PDGF-BB（10ng/ml）組、PDGF-BB（10ng/ml）+ miR-145組及miR-NC組。CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況；實(shí)時(shí)RT-PCR方法檢測(cè)miR-145過(guò)表達(dá)后對(duì)PCNA、c-Jun及SM22a mRNA水平的影響；Western印跡方法檢測(cè)miR-145過(guò)表達(dá)后對(duì)VSMC表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志基因蛋白水平的影響。 結(jié)果：CCK-8結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，miR-NC組OD值無(wú)顯著差異（P＞0.05）；PDGF組OD值明顯升高（P0.01）；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+ miR-145組OD值明顯下降（P0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，miR-NC組PCNA、c-Jun及SM22a mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05）；PDGF組PCNA、c-JunmRNA的表達(dá)分別上調(diào)37%（P0.05）和168%（P0.01），而SM22a mRNA的表達(dá)下調(diào)80%（P0.01）；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+ miR-145組PCNA、c-Jun mRNA的表達(dá)分別下調(diào)66%和77%（P0.01），而SM22a mRNA的表達(dá)上調(diào)335%（P0.01）。Western-blot結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較，PDGF組PCNA、c-Jun mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)（P0.01），而SM22a mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)（P0.01）；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+ miR-145組c-Jun、PCNAmRNA的表達(dá)明顯下調(diào)（P0.01），而SM22amRNA的表達(dá)明顯上調(diào)（P0.01）。 結(jié)論：1.miR-145可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖；2. miR-145可上調(diào)VSMC分化相關(guān)基因而下調(diào)增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制VSMC的表型轉(zhuǎn)化。 第三部分miR-145通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制VSMC增殖 目的：選擇絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)系統(tǒng)(MAPKs)家族的3個(gè)亞類：ERK1/2、JNK/SAPK、p38MAPK，探討miR-145過(guò)表達(dá)對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的p-ERK/ERK、p-JNK/JNK及p- p38MAPK /p38MAPK蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)步分析miR-145是否通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制VSMC增殖。 方法：采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠原代VSMC，加入PDGF（10ng/ml）誘導(dǎo)VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化（即獲得增殖能力），并將細(xì)胞分為4組：正常對(duì)照組、miR-NC組、PDGF-BB（10ng/ml）+ miR-145組及PDGF-BB（10ng/ml）組。Western印跡方法檢測(cè)ERK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)、JNK和p-JNK的表達(dá)以及p38MAPK和p-p38MAPK的表達(dá)。 結(jié)果：Western-blot結(jié)果顯示:PDGF-BB（10ng/ml）誘導(dǎo)VSMC后，p-ERK、p-JNK和p- p38MAPK水平明顯上調(diào)，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。轉(zhuǎn)染miR-145干預(yù)72h后再加入PDGF-BB刺激，p-ERK、p-JNK和p- p38MAPK水平明顯下調(diào)，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）�？召|(zhì)粒組與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論：miR-145通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路的磷酸化，進(jìn)而抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 王智昊;吳揚(yáng);王英凱;;血管平滑肌細(xì)胞的增殖因素及機(jī)制[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年03期

2 龐玲品;黃石安;;血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)因素及機(jī)制的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2010年03期

3 張瑩;張勇;蔡本志;馮鐵明;李寶馨;喬國(guó)芬;王玲;呂延杰;楊寶峰;;microRNA在犬心房纖顫模型中的變化[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年02期

4 趙爽;劉默芳;;MicroRNA作用機(jī)制研究的新進(jìn)展[J];中國(guó)科學(xué)(C輯:生命科學(xué));2009年01期

5 李翰卿;汪俊軍;;microRNAs與心肌損傷[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2011年10期

6 劉斌;焦磊;徐紅濤;張艷林;王e

本文編號(hào)：2558471