【摘要】：目的研究供體細(xì)胞的rDNA狀態(tài)對(duì)核移植（NT）胚胎內(nèi)rDNA活性以及rRNA合成和加工的影響。方法通過建立了B6D2F1品系小鼠的胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells, ESCs）、顆粒細(xì)胞（cumulus cells, CCs）和胎兒成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs）細(xì)胞株，檢測(cè)了這三者在活性NORs數(shù)目、rDNA甲基化水平和核仁相關(guān)基因表達(dá)水平上的差異；之后以這三種細(xì)胞為供體細(xì)胞，用一步法核移植技術(shù)構(gòu)建了相應(yīng)的核移植（nuclear transfer, NT）胚胎，同時(shí)以單精注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）胚胎作為對(duì)照，考察了4種胚胎在原核形成、核仁蛋白分布、活性NORs數(shù)目、rDNA甲基化水平以及核仁相關(guān)基因表達(dá)等方面的差異。結(jié)果1)小鼠ICSI胚胎和NT胚胎在精子注射/激活后5h（hours post activation, hpa）開始出現(xiàn)核仁前體（nucleolar precursorbodies, NPBs），NPBs數(shù)目逐漸減少，直至8hpa時(shí)趨于穩(wěn)定并一直持續(xù)到原核融合（16-17hpa）；2)干細(xì)胞核移植（embryonic stem cell nuclear transfer, ESNT）胚胎原核期僅有一個(gè)類原核，平均內(nèi)含7.20個(gè)NPBs；顆粒細(xì)胞（cumulus cellnuclear transfer, CCNT）、成纖維細(xì)胞核移植（mouse embryonic fibroblast nucleartransfer, MEFNT）胚胎、ICSI胚胎和孤雌（parthenogenetic activation, PA）胚胎在原核期都形成2個(gè)原核/類原核，平均每個(gè)原核/類原核內(nèi)分別含3.71、4.27、1.58和1.59個(gè)NPBs；3)晚2細(xì)胞期的ICSI、ESNT和CCNT胚胎在核仁周圍開始出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。到4細(xì)胞期時(shí)，ICSI和ESNT胚胎的核仁呈現(xiàn)完全的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而CCNT胚胎核仁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)仍只出現(xiàn)在周邊區(qū)域；4)0.8μg/ml放線菌素D（actinomycin D,AD）處理顆粒細(xì)胞1h能使其失去rRNA轉(zhuǎn)錄和加工活性。以AD處理后的顆粒細(xì)胞作為供體構(gòu)建的NT胚胎，其植入前發(fā)育能力和未處理組并無顯著差異；5) ESCs有最多的活性核仁組織區(qū)（nucleolar organizingregions， NORs）數(shù)目（7.66）和最低的rDNA甲基化水平（6.76%），而且其UBF(upstream binding factor，上游結(jié)合因子)、 FBL(fibrillarin)和B23(nucleophosmin，核仁素)的表達(dá)水平顯著高于CCs和MEFs；MEFs含最少的活性NORs數(shù)目（4.70）和最高的rDNA甲基化水平（22.57%）；CCs的數(shù)據(jù)居于兩者之間（6.45和13.59%）；6)4細(xì)胞期時(shí)，ESNT胚胎含有與ICSI相當(dāng)?shù)幕钚訬ORs數(shù)（7.19vs.7.44），顯著高于CCNT（6.68）和MEFNT胚胎（5.77）。MEFNT胚胎的rDNA甲基化水平顯著高于其他3組胚胎（15.52%vs.9.39%/ICSIvs.6.36%/ESNT vs.9.67%/CCNT）。7) CCs和MEFs的核進(jìn)入卵母細(xì)胞后，，B23和UBF信號(hào)在20min后消失；而ESCs的核內(nèi)B23/UBF信號(hào)在1h仍能檢測(cè)到；8) MEFNT胚胎的植入前發(fā)育能力低于ICSI、ESNT和CCNT胚胎；桑葚胚期其FBL和18S rRNA的表達(dá)顯著低于另外三組胚胎，UBF和47S rRNA的表達(dá)顯著低于ICSI胚胎。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)闡明了供體細(xì)胞本身和核移植胚胎內(nèi)核仁蛋白的分布情況和變化；揭示了不同分化程度的供體細(xì)胞在rDNA的活性上存在一定差異，并且這種差異很大程度決定了不同核移植胚胎中的rDNA活性的差別，進(jìn)而影響核移植胚胎植入前的發(fā)育能力。
【圖文】：

圖 3 “兩步法”和“一步法”核移植操作過程Fig.3 Manipulation procedures of “2-step” and “one-step” nuclear transfer technique1) 將卵母細(xì)胞取出，10-20 枚一批放入含 5μg/ml CB 的 HEPES-CZB 操；

在體視顯微鏡下觀察，如表面有玻璃碎片必須除去(圖 4 C)。3.6.4 超薄切片和電鏡觀察將回收來的樣品柱頂面修成邊長(zhǎng)約1.5 mm的矩形(圖4 D)，之后進(jìn)行超薄切片，醋酸鈾染色并干燥后，透射電鏡下觀察并獲取圖像。圖 4 目標(biāo)半薄切片的重包埋和回收A，光學(xué)顯微鏡下的半薄切片；B，對(duì)目標(biāo)半薄切片進(jìn)行重包埋；C，倒置顯微鏡觀察回收的半薄切片；D，用于超薄切片的樣品柱Fig.4 Re-embed and recycle of target semi-thin sectionsA: semi-thin section under light microscope; B: re-embed of targetsemi-thin sections; C: recycled semi-thin section under reversemicroscope; D: sample before conduct untra-thin section.3.7 放線菌素 D 處理顆粒細(xì)胞用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)的顆粒細(xì)胞培養(yǎng)于腔室玻片中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，往不同的孔中分別加入放線菌素 D（actinomycin D
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2554374