發(fā)布時(shí)間：2019-10-28 23:51

【摘要】：剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，屬原生動(dòng)物門，孢子蟲綱。它能夠感染多種家禽及野生生物，包括鳥類及人類；由其引起的弓形蟲�。═oxoplasmosis）是一種呈全球性分布的重要的人獸共患病。人群普遍容易感染弓形蟲。人可以通過攝食生的或未被煮熟的含有包囊的肉而感染，或接觸被貓或其他被感染的貓科動(dòng)物排泄物中包囊污染的土壤、食物或水而感染。大多數(shù)免疫功能正常的人感染弓形蟲后呈隱性感染，無明顯癥狀。女性在懷孕前感染弓形蟲通常不會(huì)將感染傳給胎兒；然而如果孕期(妊娠3-5周)感染弓形蟲，弓形蟲就會(huì)通過胎盤屏障傳播給胎兒，引起流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎及先天性弓形蟲病。先天性弓形蟲病在胎兒和嬰兒中可引起腦積水、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、肝脾腫大、血小板減少癥、小頭畸形等，嚴(yán)重者引起死亡。弓形蟲病的診斷方法有直接鏡檢、病原學(xué)檢查、動(dòng)物接種、卵囊分離、免疫學(xué)檢測、間接血凝試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。 本實(shí)驗(yàn)通過利用弓形蟲速殖子提取的總RNA進(jìn)行弓形蟲表達(dá)文庫的構(gòu)建，并用慢性感染弓形蟲的大鼠血清對構(gòu)建好的弓形蟲文庫進(jìn)行免疫學(xué)篩選，以便獲得高反應(yīng)原性的抗原基因，為下一步制備高反應(yīng)性的重組蛋白用于弓形蟲病的診斷奠定基礎(chǔ)。 方法：本實(shí)驗(yàn)通過培育幼鼠腎細(xì)胞（BHK）來進(jìn)行弓形蟲ME49株速殖子的體外培養(yǎng)與傳代，純化出弓形蟲速殖子，利用Trizol Reagent提取出弓形蟲總RNA，以總RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下分別反轉(zhuǎn)錄出cDNA的第一鏈及第二鏈，以及一系列的蛋白酶K處理，sfi酶切，用CHROMA SPIN H-1000進(jìn)行過柱分離，與λTriple×2載體相連，最終經(jīng)過體外包裝形成cDNA初始文庫；對初始文庫進(jìn)行滴度檢測，文庫擴(kuò)增，最后進(jìn)行篩庫.用弓形蟲感染大鼠6周后取其血清篩選表達(dá)性文庫。將篩選出的陽性斑挑出，置于1ml SM buffer中。繼續(xù)進(jìn)行二次篩選，將篩選出的陽性斑置于1ml SM buffer中。將兩次篩選出的陽性斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將片段與PMD-18T連接后測序。 結(jié)果：原始cDNA文庫容量為4×10~7pfu，擴(kuò)增后的滴度為4.2×10~9pfu/ml，文庫的重組率大于95%，初篩后共篩出陽性克隆40個(gè)，復(fù)篩后持續(xù)陽性的克隆共有26個(gè)，通過測序結(jié)果表明共篩到2個(gè)cDNA分子，分別編碼弓形蟲ME49株ROP8蛋白和CELF蛋白。 結(jié)論：成功構(gòu)建弓形蟲ME49株cDNA表達(dá)文庫，采用人工感染的大鼠血清對文庫進(jìn)行篩選，通過測序分析獲得2個(gè)cDNA分子，分別編碼弓形蟲ME49株ROP8蛋白和CELF蛋白，這兩種蛋白有望成為弓形蟲感染的新的診斷抗原。
【圖文】：

② 文庫中加入文庫體積 7%的 DMSO，-80℃保存。1.3 結(jié)果1. 總 RNA 提取及純度鑒定： Trizol Reagent 獲得速殖子提取的 RNA 分別4ul，6ul，8ul 經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察到清晰的 28 s 和 18 s rRNA 條圖 1.1。混合后的總 RNA 測定其 OD260/280=1.91。結(jié)果表明，，提取的 RNA合提取要求。2.弓形蟲速殖子 ME49 株雙鏈 cDNA 的合成合成的雙鏈 cDNA 取 5ul 進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳顯示：cDNA 平均大小為 1-右，表明符合 cDNA 合成規(guī)律，見圖 1.2.M 1 M

② 文庫中加入文庫體積 7%的 DMSO，-80℃保存。1.3 結(jié)果1. 總 RNA 提取及純度鑒定： Trizol Reagent 獲得速殖子提取的 RNA 分別4ul，6ul，8ul 經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察到清晰的 28 s 和 18 s rRNA 條圖 1.1。混合后的總 RNA 測定其 OD260/280=1.91。結(jié)果表明，提取的 RNA合提取要求。2.弓形蟲速殖子 ME49 株雙鏈 cDNA 的合成合成的雙鏈 cDNA 取 5ul 進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳顯示：cDNA 平均大小為 1-右，表明符合 cDNA 合成規(guī)律，見圖 1.2.M 1 M
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 程彥斌;弓形蟲病實(shí)驗(yàn)診斷研究的進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).寄生蟲病分冊;1996年05期

2 趙艷軍,李丙午,劉群,賀耀亮;兒童弓形蟲病141例臨床分析[J];人民軍醫(yī);1996年03期

3 呂元聰;IHA診斷弓形蟲病的幾個(gè)影響因素及其處理方法[J];廣西預(yù)防醫(yī)學(xué);1998年01期

4 周永安;弓形蟲病診斷技術(shù)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J];中國人獸共患病雜志;2003年05期

5 徐鳳全,林玲;我國弓形蟲病核酸疫苗研究概況[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2005年08期

6 徐克繼;各地弓形蟲病血清學(xué)調(diào)查綜合報(bào)道[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;1988年01期

7 ;弓形蟲病血清學(xué)診斷質(zhì)量控制會(huì)議會(huì)議紀(jì)要[J];中國人獸共患病雜志;1992年04期

8 楊迎工，韓勝凱，高虹，劉曉星;不孕癥與弓形蟲感染的檢測意義[J];男科學(xué)報(bào);1995年01期

9 李丙午,趙艷軍,劉群;兒童高熱驚厥型弓形蟲病8例[J];前衛(wèi)醫(yī)藥雜志;1997年01期

10 趙艷軍,賀耀亮,劉群,吳廣梅;兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)弓形蟲病323例[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2000年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 程漢良;姬南京;彭永興;申欣;吳陳晨;許建和;董志國;;草魚乙酰輔酶A羧化酶基因全長cDNA克隆[A];2010年中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2011年

2 李西雷;汪桂玲;李家樂;;三角帆蚌GPX基因cDNA全序列克隆及其結(jié)構(gòu)特征[A];中國動(dòng)物學(xué)會(huì)、中國海洋湖沼學(xué)會(huì)貝類學(xué)會(huì)分會(huì)第十四次學(xué)會(huì)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2009年

3 孫希萌;盧致民;向梅;劉賢勇;索勛;;吉林和河北地區(qū)人群弓形蟲病血清學(xué)調(diào)查[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

4 李西雷;汪桂玲;李家樂;袁一鳴;;三角帆蚌GPX基因cDNA全序列的克隆及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析[A];2010年中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2011年

5 ;Constructing cDNA Microarray to Isolate Novel Differentially Expressed Genes Related to Human Glioma and Characterizations of Novel Full-length Gene PPIL-3[A];中國抗癌協(xié)會(huì)神經(jīng)腫瘤專業(yè)委員會(huì)第八屆學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

6 劉丹丹;李建梅;韓宏曉;王尚尚;曹李琴;許金俊;陶建平;;巨型艾美耳球蟲免疫原性相異株間差異表達(dá)基因消減cDNA文庫的構(gòu)建與分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

7 蘭歡;卜友泉;崔濤;汪長東;易發(fā)平;劉革力;宋方洲;;腫瘤相關(guān)新基因PRR11的全長cDNA克隆及其功能初步解析[A];重慶市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2009年

8 裴宗飛;張文娟;牛鐘相;;鴨補(bǔ)體C3d基因cDNA的克隆及鑒定[A];山東畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)專業(yè)委員會(huì)第一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

9 郝麗;李和平;嚴(yán)歷;;東北梅花鹿鹿茸尖端組織全長cDNA文庫的構(gòu)建[A];2010中國鹿業(yè)進(jìn)展[C];2010年

10 熊梅;穆亞芳;劉家森;原東偉;郭東春;姜騫;林歡;曲連東;;兔肝cDNA文庫的構(gòu)建[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 白軼南;弓形蟲病 危及胎兒健康[N];保健時(shí)報(bào);2005年

2 王志海 邵芹;犬弓形蟲病[N];中國畜牧報(bào);2003年

3 臨城縣畜牧局 李路民;豬得弓形蟲病 吃了貓的虧[N];河北科技報(bào);2002年

4 小郭;弓形蟲病危害不輕[N];中國商報(bào);2000年

5 方芳;懷孕前，如何預(yù)防寵物�。縖N];健康時(shí)報(bào);2005年

6 戴培紅;北京友誼醫(yī)院探索治療弓形蟲病的新途徑[N];中國醫(yī)藥報(bào);2000年

7 邢臺(tái)市獸醫(yī)院 邢蘭君 高社朝;豬高燒不退 沒準(zhǔn)是弓形蟲病[N];河北科技報(bào);2002年

8 劉延年;家畜弓形蟲病的防治[N];中國畜牧水產(chǎn)報(bào);2001年

9 連孝華;孕婦玩貓狗易危害胎兒[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2007年

10 記者 周俏春;專家敬告：“準(zhǔn)媽媽”慎養(yǎng)貓[N];新華每日電訊;2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 覃川杰;瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）脂肪代謝相關(guān)基因cDNA的克隆及表達(dá)分析[D];華東師范大學(xué);2010年

2 慎小晶;蝶蛹金小蜂cDNA文庫抗菌肽基因篩選及表達(dá)研究[D];浙江大學(xué);2010年

3 姜爭;基于cDNA微陣列技術(shù)Ⅱ、Ⅲ期腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選、鑒定及應(yīng)用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

4 徐慶剛;大熊貓Leptin、Ghrelin和IL-15基因的克隆表達(dá)及胃和脾臟cDNA文庫的構(gòu)建[D];浙江大學(xué);2009年

5 李鋒;轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究海州香薷Cu吸收與耐性分子機(jī)理及其cDNA文庫的構(gòu)建[D];浙江大學(xué);2009年

6 鄧清超;具有高傳播能力的栗疫菌低毒力病毒CHV1-CN280的基因組序列測定與可侵染性全長cDNA克隆構(gòu)建[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 方強(qiáng);間日瘧原蟲全長cDNA文庫的構(gòu)建與PvGDH的克隆表達(dá)、表位鑒定及單抗研究[D];蘇州大學(xué);2010年

8 葛榮朝;小麥耐鹽相關(guān)基因cDNA的克隆與功能研究[D];河北師范大學(xué);2005年

9 劉媛;三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)cDNA文庫構(gòu)建、EST分析及抗脂多糖因子研究[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2011年

10 許亮;應(yīng)用cDNA陣列技術(shù)對肝細(xì)胞肝癌基因表達(dá)譜的研究[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 郝言明;柔嫩艾美耳球蟲兩個(gè)抗藥株消減cDNA文庫的序列分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2010年

2 鄧效禹;籽鵝垂體組織全長cDNA文庫的構(gòu)建及部分克隆序列分析[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2010年

3 李付美;萊蕪豬心臟組織cDNA文庫的構(gòu)建及部分表達(dá)序列標(biāo)簽的分析[D];曲阜師范大學(xué);2010年

4 杜雯林;蘋果褐斑病菌鈣調(diào)素基因的cDNA克隆以及序列分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

5 戰(zhàn)晴晴;柴胡全長cDNA文庫和遺傳圖譜的構(gòu)建及蠶豆病毒屬病毒的鑒定[D];東北林業(yè)大學(xué);2010年

6 王金萍;枳根全長cDNA文庫的構(gòu)建及生物信息學(xué)研究[D];西南大學(xué);2011年

7 劉磊;TMV侵染煙草基因差異表達(dá)的cDNA-AFLP分析[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2010年

8 嚴(yán)福祥;烏龜孔雀石綠浸泡后的組織病理學(xué)研究及肝臟全長cDNA文庫的構(gòu)建與鑒定[D];暨南大學(xué);2010年

9 楊朝霞;微小牛蜱雌蜱唾液腺消減cDNA文庫的構(gòu)建及卵黃蛋白原基因的原核表達(dá)[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

10 謝凱;嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)的池蝶蚌血細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建及親環(huán)蛋白基因的序列分析[D];南昌大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2553275