【摘要】：動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病。Toll樣受體2（Toll-like receptor2, TLR2）是介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)中的一種模式識別受體，研究表明TLR2在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。已證實(shí)TLR2在動脈粥樣硬化斑塊處血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，且在血流動力學(xué)紊亂的部位高表達(dá)。AS發(fā)展中內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能障礙，能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，促進(jìn)AS。本實(shí)驗(yàn)旨在探討TLR2在內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)中的作用，通過LPS和TNF-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)TLR2高表達(dá)，并通過RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)沉默TLR2，觀察TLR2對內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎癥因子的影響。 【方法】采用0.1%膠原酶消化法分離3～4月齡雄性五指山小型豬的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，并進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，使用LPS、TNF-α和LTA分別刺激該細(xì)胞0、6、8、12和24h，real-time PCR檢測TLR2和TLR4mRNA表達(dá)水平；LPS和TNF-α預(yù)刺激內(nèi)皮細(xì)胞24h后，添加LTA孵育0、6和12h，real-time PCR檢測炎癥因子IL-6、IL-8、MCP-1和黏附分子ICAM-1的mRNA表達(dá)量及ELISA檢測IL-6的分泌量。通過向內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA降低TLR2的表達(dá)，添加LTA孵育12h，檢測內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、IL-8、MCP-1和ICAM-1的mRNA表達(dá)量。 【結(jié)果】分離得到的五指山小型豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石樣，生長狀態(tài)良好。經(jīng)細(xì)胞表面抗原鑒定證實(shí)此細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞未受刺激時(shí)，TLR2的表達(dá)量很低；LPS和TNF-α刺激細(xì)胞6和8h后，TLR2表達(dá)量有所升高，12和24h后，TLR2的表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），而LTA刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，TLR2的表達(dá)量未升高。未受刺激時(shí)，可檢測到內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4的表達(dá)，而LPS和TNF-α刺激細(xì)胞后，TLR4的表達(dá)無明顯變化。LPS和TNF-α預(yù)刺激細(xì)胞24h后，TLR2表達(dá)升高并介導(dǎo)LTA刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8、MCP-1和ICAM-1的mRNA水平明顯升高，，且細(xì)胞分泌IL-6的量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過RNAi技術(shù)沉默TLR2后，LTA刺激內(nèi)皮細(xì)胞使IL-6、IL-8、MCP-1和ICAM-1mRNA表達(dá)量降低。 【結(jié)論】 1、LPS和TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞TLR2的表達(dá)量升高。說明當(dāng)LPS，革蘭氏陰性細(xì)菌的成分感染內(nèi)皮細(xì)胞，能引起TLR2表達(dá)升高；當(dāng)單核"巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)TLR2表達(dá)升高。 2、TLR2對配體LTA應(yīng)答，引起內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)升高，促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷并啟動AS。 3、TLR2基因沉默，內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)炎癥因子的量降低，則可以通過阻斷TLR2減少內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)應(yīng)答。 TLR2在介導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步研究TLR2在AS中的作用奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2548003