發(fā)布時(shí)間：2019-10-10 22:38

【摘要】：本課題共分為三個(gè)部分 第一部分：小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化成為血管平滑肌細(xì)胞的模型建立研究目的：深入了解血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)發(fā)育及分化的特點(diǎn)對于了解血管疾病的過程非常重要。然而,目前對VSMCs特異分化及終末分化誘因的研究非常有限,原因之一是缺乏一種合適的VSMCs發(fā)育模型。胚胎干細(xì)胞為早期VSMCs的譜系形成、分化及成熟機(jī)制的研究提供了一種有價(jià)值的體外模型,而從胚胎干細(xì)胞單一、定向分化成為血管平滑肌細(xì)胞為將來的進(jìn)一步研究其分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。研究方法：將充滿活力的小鼠胚胎干細(xì)胞D3系種植于Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)皿/板上,經(jīng)過8天的誘導(dǎo)分化,取其中的2、4、6、8天各個(gè)點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR及免疫印跡試驗(yàn),驗(yàn)證其平滑肌標(biāo)志基因SMA、SM22、calponin、SM-MHC的表達(dá)水平。 研究結(jié)果：Ⅳ型膠原成功誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化成為平滑肌細(xì)胞,平滑肌標(biāo)志基因及蛋白可隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而同步增加,最高峰在第8天。 結(jié)論：利用Ⅳ型膠原的誘導(dǎo)分化,成功建立起胚胎干細(xì)胞單一、定向分化成為血管平滑肌細(xì)胞的體外模型,為進(jìn)一步探討其分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 第二部分：血管緊張素Ⅱ促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化成為血管平滑肌細(xì)胞 研究目的：體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ不僅僅是一個(gè)體液調(diào)節(jié)因子,它還是一種促血管新生的因子,可以刺激成血管細(xì)胞,包括內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化及凋亡。本實(shí)驗(yàn)旨在探明AngⅡ在胚胎干細(xì)胞分化成為血管平滑肌細(xì)胞過程中本身所具有的生理作用。 研究方法：采用在Ⅳ型膠原誘導(dǎo)分化過程中最有分化變化的第四天的干細(xì)胞,加入不同濃度的AngⅡ刺激(10-6-10-14mol/L)48小時(shí)后檢測平滑肌標(biāo)志基因SMA、 SM22、calponin、SM-MHC的基因及蛋白表達(dá)水平。同時(shí)對AngⅡ10-9mol/L組及對照組進(jìn)行免疫熒光的染色比較。此外還分析了AngⅡ(10-6-10-10mol/L)的刺激是否與促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)的MTT研究。 研究結(jié)果：AngⅡ可以濃度依賴性的刺激上述標(biāo)志基因的改變,在mRNA水平SMA、 SM22、calponin及SM-MHC的刺激最高峰處在10-9mol/L(p0.01),而在蛋白水平SMA、SM22及calponin的峰值在10-9mol/L(p0.01)。同時(shí)免疫熒光染色也顯示出增強(qiáng)的標(biāo)志基因SMA、SM22、calponin的熒光強(qiáng)度,但是SM-MHC的熒光改變不明顯。此外AngⅡ不同濃度刺激下細(xì)胞增殖并未發(fā)生明顯改變. 結(jié)論：AngⅡ可以濃度依賴性的刺激平滑肌標(biāo)志基因的表達(dá),從而可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化成為血管平滑肌細(xì)胞,此促進(jìn)分化的過程與促進(jìn)細(xì)胞增殖無關(guān)。 第三部分：血管緊張素Ⅱ促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化成為血管平滑肌細(xì)胞的機(jī)制探討 研究目地：本部分通過對AngⅡ細(xì)胞外信號通路的探索,重點(diǎn)研究其促進(jìn)分化過程中的主要參與部分,包括血管緊張素Ⅱ的受體及磷脂酰肌醇3激酶PI3K/Akt信號通路,同時(shí)探討AngⅡ在轉(zhuǎn)錄因子水平對分化調(diào)控的可能參與因子。 研究方法：Ⅳ型膠原誘導(dǎo)分化第四天的胚胎干細(xì)胞中,預(yù)先加入AngⅡⅠ型受體(AT1R)阻斷劑氯沙坦(losartan)、AngⅡⅡ型受體(AT2R)阻斷劑PD123319,及NF-κB抑制劑BAY11-7082,后給予AngⅡ10-9mol/L的刺激,檢測平滑肌標(biāo)志基因蛋白SMA及calponin的改變。PI3K/Akt信號通路研究上,主要通過AngⅡ不同濃度(10-6-10-10mol/L)刺激下檢測相關(guān)的PI3K下游磷酸化Akt的變化；同時(shí)分析PI3K阻斷劑LY294002作用下平滑肌標(biāo)志基因蛋白SMA和calponin(?)及磷酸化Akt的改變。此外在轉(zhuǎn)錄水平檢測AngⅡ不同濃度(10-6-10-10mol/L)對平滑肌標(biāo)志基因SMA及SM22啟動(dòng)子活性的影響,及對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因(?)(?)NF-Kappa B (NF-κB p50, p65), c-Jun等的作用。關(guān)于AngⅡ促進(jìn)分化是否涉及炎癥相關(guān)基因蛋白的表達(dá)的驗(yàn)證,是通過檢測AngⅡ激下(10-6-10-10mol/L)兩個(gè)炎癥相關(guān)蛋白TNF-a及c-fos的表達(dá)來進(jìn)行。研究結(jié)果：AngⅡ(10-9mol/L)的促進(jìn)平滑肌標(biāo)志基因SMA和calponin表達(dá)的作用可以被AngⅡⅠ型受體阻斷劑losartan(?)所阻斷,而非AngⅡⅡ型受體阻斷劑PD123319。AngⅡ濃度依賴性的促進(jìn)磷酸化Akt的表達(dá),在AngⅡ10-9mol/L(P0.01)刺激下達(dá)最高峰。PI3K抑制劑LY294002可以阻斷Ang Ⅱ刺激的平滑肌標(biāo)志基因的上調(diào),同時(shí)也可以阻斷磷酸化AKt的表達(dá),但是兩組阻斷劑效果不盡相同,AngⅡ刺激組較之對照組仍然有相對高表達(dá)的平滑肌標(biāo)志基因及磷酸化Akt達(dá)水平。此外AngⅡ可以在適當(dāng)濃度(10-8-10-9mol/L)刺激平滑肌標(biāo)志基因SMA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,同時(shí)可以濃度依賴性的刺激-κB p50的表達(dá),最高刺激濃度為10-9mol/L(p0.01),而NF-κB抑制劑BAY11-7082則可抑制AngⅡ(10-9mol/L)的促進(jìn)平滑肌標(biāo)志基因SMA和calponin(?)琵達(dá)的作用(p0.01)。PI3K抑制劑LY294002可以阻斷NF-κB p50的高表達(dá),但是AngⅡ刺激組(10-9mol/L)較之對照組仍顯示出相對高的表達(dá)活性。不同濃度的AngⅡ的刺激并未顯著上調(diào)炎癥相關(guān)因子TNF-a及-fos的表達(dá)。 結(jié)論：AngⅡ主要通過AT1受體參與促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化成為血管平滑肌細(xì)胞的過程。AngⅡ雖然主要是通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用,但是仍然有其他相關(guān)機(jī)制的參與。AngⅡ還可以直接在轉(zhuǎn)錄水平刺激胚胎干細(xì)胞的分化,轉(zhuǎn)錄因子子NF-κBp50與AngⅡ刺激干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的關(guān)系非常密切,其發(fā)揮作用可以部分通過PI3K/Akt信號通路。上述的AngⅡ的促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化成為血管平滑肌細(xì)胞的作用未涉及炎癥相關(guān)基因蛋白的共同作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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1 王啟偉,樸英杰;BMP12誘導(dǎo)恒河猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為腱細(xì)胞[J];中國臨床解剖學(xué)雜志;2004年03期

2 徐延豪;杜U，

本文編號：2547350