【摘要】：第一部分RNA干擾體外沉默HUVECs的Netrin-1基因表達 目的 通過體外RNA干擾技術(shù)穩(wěn)定沉默Netrin-1基因在HUVECs mRNA和蛋白水平的表達,為后續(xù)的細(xì)胞實驗提供基礎(chǔ)。 方法 1.分離、培養(yǎng)原代HUVECs,利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫熒光實驗鑒定細(xì)胞表面Ⅷ因子和CD31的表達以驗證其內(nèi)皮細(xì)胞特性； 2.利用RNA干擾技術(shù)將表達Netrin-1 shRNA的真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染入HUVECs,并利用G418穩(wěn)定篩選； 3.利用實時熒光定量PCR檢測HUVECs在RNA干擾前后Netrin-1基因的mRNA水平表達； 4.利用免疫印跡法檢測HUVECs在RNA干擾前后Netrin-1基因的蛋白水平表達。 結(jié)果 1.分離所得的原代HUVECs,細(xì)胞形態(tài)學(xué)具有內(nèi)皮細(xì)胞特性,免疫熒光鑒定Ⅷ因子和CD31的表達強陽性； 2.RNA干擾技術(shù)體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后可得到GFP穩(wěn)定高表達的HUVECs; 3. HUVECs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shNetrin-1后,實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)其Netrin-1基因的mRNA水平表達下降了(86.54±3.10)%； 4. HUVECs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shNetrin-1后,免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)其Netrin-1基因的蛋白水平表達下降了(77.62±6.92)%。 結(jié)論 利用體外RNA干擾技術(shù)可穩(wěn)定高效沉默Netrin-1基因在HUVECs mRNA和蛋白水平的表達,為進一步的細(xì)胞生物功能學(xué)研究奠定了實驗基礎(chǔ)。 第二部分Netrin-1基因?qū)UVECs與血管形成相關(guān)能力的作用 目的 研究上調(diào)和下調(diào)Netrin-1的表達對HUVECs細(xì)胞活力、增殖、遷移和管腔形成能力的影響,了解Netrin-1基因在HUVECs形成血管過程中的作用。 方法 1.將HUVECs分為對照組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒shVetor,在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)),Netrin-1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒shVetor,在含100ng/ml Netrin-1的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)),shNetrin-1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒shNetrin-1,在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng))3組； 2.利用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)比色法分別檢測3組HUVECs12、24、48小時的細(xì)胞活力； 3.利用克隆形成法檢測3組HUVECs的增殖能力； 4.利用transwell模型遷移實驗檢測3組HUVECs的遷移能力； 5.利用小管形成實驗檢測3組HUVECs的管腔形成能力。 結(jié)果 1.給予Netrin-1刺激24小時后,HUVECs細(xì)胞活力明顯提高；沉默Netrin-1的表達24小時后,HUVECs細(xì)胞活力明顯下降； 2. Netrin-1干預(yù)的HUVECs克隆形成率由shVector組的(60±6.67)%提高至(92.22±5.09)%；沉默Netrin-1表達的HUVECs克隆形成率則降至(30±3.33)%(p0.05); 3.與shVector組(81.8±7.95)相比,Netrin-1組HUVECs的細(xì)胞遷移數(shù)目可達(124.2±15.9);shNetrin-1組HUVECs的細(xì)胞遷移數(shù)目降至(40.4±8.56)(p0.05)； 4.與shVector組(32.6±3.13)相比,Netrin-1可增加HUVECs管腔形成分支點 數(shù)目(57.4±6.88)；沉默Netrin-1則使其減少(19.6±4.45)(p0.05)。 結(jié)論 外源性給予Netrin-1可以促進HUVECs的細(xì)胞活力、增殖、遷移和管腔形成能力；沉默Netrin-1表達則可以抑制HUVECs以上與血管形成相關(guān)的各項生物學(xué)功能。Netrin-1是重要的促HUVECs細(xì)胞活力、增殖、遷移和管腔形成能力的基因。 第三部分RNA干擾體內(nèi)沉默孕鼠胎盤的Netrin-1基因表達 目的 通過體內(nèi)RNA干擾技術(shù)沉默Netrin-1基因在孕鼠胎盤mRNA和蛋白水平的表達,為后續(xù)動物水平的研究提供實驗基礎(chǔ)。 方法 1.利用體內(nèi)RNA干擾技術(shù)將表達Netrin-1 shRNA的真核表達載體轉(zhuǎn)染入孕鼠胎盤組織； 2.轉(zhuǎn)染后的孕鼠組織行冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察GFP表達以了解質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果； 3.利用實時熒光定量PCR檢測RNA干擾前后的孕鼠胎盤組織Netrin-1基因的mRNA水平表達； 4.利用免疫印跡法和免疫組化實驗定量和定位檢測RNA干擾前后的孕鼠胎盤組織Netrin-1基因的蛋白水平表達。 結(jié)果 1.轉(zhuǎn)染后胎盤組織的冰凍切片在熒光下觀察可見GFP大面積高表達,體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果理想； 2.孕鼠胎盤體內(nèi)轉(zhuǎn)染shNetrin-1后,實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)其Netrin-1基因的mRNA水平表達下降(63.49±9.58)%； 3.孕鼠胎盤體內(nèi)轉(zhuǎn)染shNetrin-1后,免疫印跡法發(fā)現(xiàn)其Netrin-1基因的蛋白水平表達下降(57.93±11.76)%；免疫組織化學(xué)實驗顯示Netrin-1主要表達于胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞。 結(jié)論 利用體內(nèi)RNA干擾技術(shù)可有效沉默Netrin-1基因在孕鼠胎盤mRNA和蛋白水平的表達,為后續(xù)動物水平的在體研究奠定了實驗基礎(chǔ)。 第四部分Netrin-1基因?qū)μケP血管生成和胎兒發(fā)育的作用 目的 研究上調(diào)和下調(diào)Netrin-1的表達對孕鼠胎盤血管生成和胎鼠發(fā)育的影響,了解Netrin-1基因在胎盤血管形成過程中的作用。 方法 1.將56只孕鼠隨機分成4組,孕14天時行相應(yīng)的胎盤定位注射：對照組(20ul生理鹽水),Netrin-1組(20ul含400ng重組Netrin-1因子的生理鹽水),shVector組(20ul含10ug shVector的轉(zhuǎn)染復(fù)合物),shNetrin-1組(20ul含10ug shNetrin-1的轉(zhuǎn)染復(fù)合物); 2.測量孕17天大鼠干預(yù)注射后胎盤及胎鼠的重量； 3.利用CD34因子免疫組化實驗檢測孕17天大鼠干預(yù)注射后的胎盤血管密度。 結(jié)果 1.與對照組(1.57±0.1)g相比,Netrin-1組孕鼠的胎盤重量(1.83±0.12)g明顯增加；與shVector組(1.53±0.11)g相比,shNetrin-1組孕鼠的胎盤重量(1.35±0.09)g明顯下降(p0.05)； 2.CD34的免疫組化實驗結(jié)果顯示,Netrin-1組孕鼠胎盤的微血管數(shù)量(98.4±9.07)較對照組(80.2±5.89)顯著增多；shNetrin-1組孕鼠胎盤的微血管密度(54.0±5.34)較shVector組(75.6±7.3)顯著減少(p0.05)； 3.與對照組(2.46±0.18)g相比,Netrin-1組的胎鼠重量(2.67±0.10)g增加；與shVector組(2.40±0.14)g相比,shNetrin-1組的胎鼠重量(2.10±0.20)g下降(p0.05)。 結(jié)論 外源性給予Netrin-1可以促進孕鼠胎盤的血管形成能力和胎鼠的生長發(fā)育；沉默Netrin-1表達則可以使孕鼠胎盤的血管形成能力和胎鼠的生長發(fā)育受到抑制。Netrin-1基因是促胎盤血管生長發(fā)育的重要基因。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R321

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