本文關鍵詞：MiR-124在非洲爪蟾視網(wǎng)膜細胞分化中的作用和機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：神經(jīng)細胞的發(fā)生和分化機制是神經(jīng)發(fā)育生物學的基本科學問題,也是揭示相關神經(jīng)和精神疾病機理的基礎。神經(jīng)細胞的產(chǎn)生是建造神經(jīng)系統(tǒng)的第一步。神經(jīng)元一旦產(chǎn)生就不能再被取代。這意味著,一個細胞是否將變成神經(jīng)元,并成為神經(jīng)元的哪一部分的哪一類神經(jīng)元,在發(fā)育早期就已經(jīng)決定并且是不可改變的。這個決定過程依賴于基因,是通過基因的表達這一選擇過程完成的。體內(nèi)每一個細胞都攜帶著相同的DNA,神經(jīng)元前體中的基因表達是如何進行選擇而產(chǎn)生不同的神經(jīng)元的呢?。近年誘導多能干細胞技術的發(fā)展為干細胞在神經(jīng)結構和功能損傷修復中的利用帶來希望,但已有的研究結果顯示多能干細胞在體內(nèi)發(fā)育的命運具有時空依賴性而其機制尚未完全明了,如何在體內(nèi)控制干細胞的定向分化仍是尚待解決的問題MiRNA是一類內(nèi)生由蛋白質(zhì)編碼基因或者非編碼基因的內(nèi)含子轉錄加工而來的約22個核苷酸分子的非編碼RNA小分子,通過降解目標基因或與目標mRNA的3’非編碼區(qū)序列互補抑制其轉錄過程,造成基因的表達量下降,參與調(diào)節(jié)動物的發(fā)育。已知的哺乳動物miRNA中約有50%在成體大腦和發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)存在,參與對胚胎和成體神經(jīng)干細胞發(fā)育和分化多個階段的調(diào)控。對miRNA在神經(jīng)細胞發(fā)生中作用的分析將有助于全面解析神經(jīng)發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡,也將為miRNA在相關神經(jīng)疾病治療中的應用提供重要的線索。MiRNA表達具有時間、組織表達特異性。一個miRNA可以調(diào)控多個靶基因,一個基因也可能受到多個miRNA的調(diào)節(jié)。所以,niRNA功能和復雜調(diào)控網(wǎng)絡的分析仍是目前的挑戰(zhàn)性問題。MiR-124(過去有miR-124a, miR-124b等分類,現(xiàn)統(tǒng)稱為miR-124)是一個特異性表達在神經(jīng)系統(tǒng)的miRNA,在大腦和眼睛的發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要的作用。我們之前的文章報道過,miR-124能夠調(diào)節(jié)早期神經(jīng)發(fā)生,爪蟾體內(nèi)若缺乏miR-124會導致視神經(jīng)和視杯的畸形。然而,miR-124是否參與視網(wǎng)膜細胞命運的特化過程以及其中潛在的分子機制在很大程度上都是未知的,仍待探究。研究結果：我們通過實驗發(fā)現(xiàn)miR-124能夠影響視網(wǎng)膜雙極細胞和水平細胞的細胞命運,而不影響其它細胞在視網(wǎng)膜的命運。MiR-124在視網(wǎng)膜過表達會導致視網(wǎng)膜雙極細胞比例降低、水平細胞比例升高。免疫組化結果證明,miR-124過表達導致OTX2特異性標記的雙極細胞比例減少,而抑制miR-124表達會導致視網(wǎng)膜雙極細胞比例升高,。這說明miR-124在雙極細胞的細胞命運特化過程中發(fā)揮重要作用。通過進一步實驗發(fā)現(xiàn)Otx2參與了miR-124對視網(wǎng)膜細胞命運的調(diào)控過程。通過生物信息學分析結果發(fā)現(xiàn)miR-124與Otx2 mRNA的3’端非編碼序列是互補的,且這種互補在多種脊椎動物物種之間都是相當保守的。我們進一步通過體外熒光素酶實驗證明miR-124可通過作用于Otx2 mRNA的3’端非編碼序列抑制蛋白的表達量。而且Otx2mRNA能夠挽回miR-124過表達造成的視網(wǎng)膜細胞命運改變的效應。從分子水平上和組織水平上都證明了OTX2可能參與了miR-124對視網(wǎng)膜雙極細胞和水平細胞細胞命運的調(diào)控。研究結論：miR-124過表達影響視網(wǎng)膜雙極、水平細胞的命運；并可通過調(diào)控Otx2表達調(diào)節(jié)爪蟾視網(wǎng)膜雙極細胞的發(fā)生。本研究結果不僅有助于解析神經(jīng)發(fā)育分子調(diào)控網(wǎng)絡,也為利用miRNA進行細胞的定向誘導分化和相關神經(jīng)疾病研究提供了新的線索。
【關鍵詞】：細胞命運特化 視網(wǎng)膜 microRNA miR-124 Otx2基因 爪蟾 發(fā)育 神經(jīng)系統(tǒng) 雙極細胞
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R338.3
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 英文縮略詞9-10
• 文獻綜述10-23
• 1 脊椎動物胚胎發(fā)育10-15
• 1.1 脊椎動物發(fā)育模式10
• 1.2 神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育10-12
• 1.3 神經(jīng)管的初始分化12-13
• 1.4 眼睛的早期發(fā)育13
• 1.5 視網(wǎng)膜的神經(jīng)發(fā)生13-15
• 2 脊椎動物早期發(fā)育的遺傳調(diào)控15-18
• 2.1 同源異型盒基因15-16
• 2.2 轉錄因子16
• 2.3 Otx2基因16-18
• 3 MicroRNA18-22
• 3.1 MicroRNA簡介18-19
• 3.2 MiRNA發(fā)展簡史19
• 3.3 MiRNA的生物合成和作用機制19-20
• 3.4 MiRNA的研究現(xiàn)狀20-21
• 3.5 MiR-124與神經(jīng)系統(tǒng)21-22
• 4 實驗動物爪蟾22-23
• 前言23-28
• 實驗設計26-27
• 實驗技術路線27-28
• 材料和方法28-35
• 實驗方法28-34
• 1. 實驗動物及其胚胎的獲取和處理28
• 2. 脂質(zhì)體轉染28-29
• 3. 冰凍切片29
• 4. 免疫組化29-30
• 5. PCR擴增30
• 6. PCR產(chǎn)物純化30-31
• 7. DNA酶切31
• 8. 質(zhì)粒鏈接31
• 9. 轉化感受態(tài)細胞31
• 10. 質(zhì)粒擴增31
• 11. 挑取菌落培養(yǎng)31-32
• 12. 細胞復蘇32
• 13. 細胞傳代32
• 14. 細胞質(zhì)粒轉染32-33
• 15. 細胞裂解33
• 16. 熒光值測定33
• 17. 統(tǒng)計學處理33-34
• 實驗材料34-35
• 1. 實驗儀器34
• 2. 實驗材料34-35
• 結果35-53
• 第一部分：MiR-124影響爪蟾視網(wǎng)膜細胞命運決定35-41
• 1.1 pCS2-gfp-miR124質(zhì)粒有效性驗證35-39
• 1.2 MiR-124過表達抑制爪蟾視網(wǎng)膜雙極細胞生成,促進水平細胞增加39-41
• 第二部分：MiR-124可直接作用于Otx23’UTR41-46
• 2.1 不同物種miR-124、Otx23'UTR序列比對同源性高41-43
• 2.2 熒光素酶試驗測定miR-124直接作用Otx2靶序列抑制蛋白表達43-46
• 第三部分：MiR-124通過調(diào)節(jié)Otx2表達控制雙極細胞命運46-53
• 3.1 MiR-124過表達抑制視網(wǎng)膜OTX2陽性雙極細胞生成46-47
• 3.2 MiR-124表達下調(diào)促進視網(wǎng)膜雙極細胞增加47-49
• 3.3 0 tx2 mRNA過表達促進視網(wǎng)膜雙極生成49-50
• 3.4 0 tx2 mRNA與miR-124過表達質(zhì)粒共轉染能夠挽回miR-124過表達造成的細胞命運改變50-53
• 討論53-54
• 參考文獻54-61
• 致謝61-62
• 個人簡歷62

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1 許紅平,楊雄里;視網(wǎng)膜雙極細胞的突觸傳遞[J];生理科學進展;2001年03期

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1 孫夢茹;MiR-124在非洲爪蟾視網(wǎng)膜細胞分化中的作用和機制[D];北京中醫(yī)藥大學;2015年

  本文關鍵詞：MiR-124在非洲爪蟾視網(wǎng)膜細胞分化中的作用和機制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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