【摘要】：目的：人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hADSCs)是一種具有很強(qiáng)的體外增殖能力和分化潛能的干細(xì)胞,因存在生物學(xué)特性穩(wěn)定、來源充足、易于體外培養(yǎng)等優(yōu)勢已引起各國學(xué)者的關(guān)注。本研究旨在：①建立hADSCs的原代培養(yǎng)體系,并在無血清培養(yǎng)基中將其轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞；②觀察hADSCs與聚ε-己內(nèi)酯共聚物可降解材料的相容性,增長速率以及轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮細(xì)胞的程度,為hADSCs成血管的臨床應(yīng)用提供體外的研究依據(jù)；③觀察褪黑素對hADSCs轉(zhuǎn)分化內(nèi)皮細(xì)胞和血管形成過程中,內(nèi)皮細(xì)胞表型vWF、VE-cadherin表達(dá),細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度以及ERK、p-ERK表達(dá)的變化,探索褪黑素對hADSCs轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮細(xì)胞的促進(jìn)、血管形成及保護(hù)機(jī)制。 方法：從健康人體抽脂術(shù)獲得的脂肪,利用本實(shí)驗(yàn)室建立的培養(yǎng)方法,進(jìn)行hADSCs的原代培養(yǎng),并用流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫表型和成骨和脂肪細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)檢測其干細(xì)胞的分化能力;用含40ng/ml的VEGF和10ng/ml的bFGF的無血清分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)hADSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測vWF和VE-Cadherin兩種內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)抗原,透射電鏡檢測WP小體、成血管實(shí)驗(yàn)和Dil-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)來檢測是否分化為內(nèi)皮細(xì)胞。將hADSCs種植在孔徑分別為60-80μm和180-200μm的聚ε己內(nèi)酯共聚物材料上,計(jì)算接種率。用掃描電鏡及免疫熒光標(biāo)記發(fā)觀察細(xì)胞在材料上的分布及相容性,CCK-8法繪制增殖曲線。在材料進(jìn)行hADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn),分化50天后用流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)皮細(xì)胞表型vWF和VE-Cadherin,及免疫熒光法檢測Flk-1。選擇不同濃度(10、1.0和0.1μmol/L)的MT作用于第三代hADSCs處理8d后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測vWF和VE-Cadherin變化。用激光共聚焦顯微鏡檢測Fluo-3標(biāo)記的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)變化。將不同濃度MT處理24 h的hADSC種植至Matrigel膠上,觀察細(xì)胞成血管能力。利用Western blot技術(shù)分析MT處理8d后hADSCs的ERK和p-ERK表達(dá)水平。 結(jié)果：①hADSCs經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析,CD45 (-) CD14 (-) CD44 (+) CD29 (+) CD105(+)表明該細(xì)胞為人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,并且可分化成骨成脂細(xì)胞。隨著分化時(shí)間的延長,vWF和VE-Cadherin的表達(dá)不斷增加,并且可在電鏡下觀察到WP小體的出現(xiàn)以及在光鏡下觀察到分化30天的hADSCs具有成血管的能力和攝取Dil-Ac-LDL的能力。②種植到材料上后,掃描電鏡下觀察細(xì)胞呈長梭形依附于多孔材料表面。60-80μm孔徑的材料細(xì)胞接種率為(98.33±0.33)%,明顯大于180-200μm孔徑材料上的細(xì)胞接種率(90.33±1.45)%；增殖曲線亦是如此。選擇60-80μm孔徑的材料進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),分化50天后,流式細(xì)胞術(shù)檢測vWF和VE-cadherin的陽性率分別為(80.9±0.90)%和(84.3±1.10)%，免疫熒光化學(xué)檢測Flk-1顯示大多數(shù)細(xì)胞表面均表達(dá)Flk-1。③1Oμmol/LMT處理的hADSCs的vWF(13.15±4.55)%和VE-Cadherin (17.96+8.74)%較空白對照組的vWF和VE-Cadehrin無顯著性差異(P0.05)；而1μmol/L MT處理的hADSCs的vWF(19.99±1.74)%和VE-Cadherin(21.13±9.74)%,以及0.1μmol/LMT處理的hADSCs的vWF(43.66±0.89)%和VE-Cadherin(49.42±4.92)%,均明顯高于空白對照組(P0.05)。40μmol/L預(yù)處理24小時(shí)后再給予MT的hADSCs的vWF和VE-cadherin陽性率均明顯低于MT直接加藥組。10、1.0和0.1μmol/L MT處理8天后的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)[Ca2+]i較非MT分化8天組分別升高-46.02%、12.27%和99.09%。在倒置相差顯微鏡下發(fā)現(xiàn),1.0和0.1μmol/L MT處理24h后,hADSC形成血管管腔結(jié)構(gòu)；空白對照組和10μmol/LMT組hADSCs無血管管形結(jié)構(gòu)形成,40μmol/L預(yù)處理24小時(shí)后再給予MT的hADSCs也無法形成血管管形結(jié)構(gòu)。與空白對照組相比,0.1μmol/LMT處理組hADSC p-ERK水平明顯增高(P0.05),1Oμmol/L組p-ERK降低顯著(P0.05),而三個(gè)不同濃度藥物組ERK水平和空白組相比無顯著性差異(P0.05) 結(jié)論：①本實(shí)驗(yàn)成功從人體脂肪中分離得到間充質(zhì)干細(xì)胞,并且在無血清條件下可將其分化為內(nèi)皮細(xì)胞。②將hADSCs種植在孔徑分別為60-80μm和180-200μm的聚ε-己內(nèi)酯共聚物材料上,孔徑大小為60-80μm聚ε-己內(nèi)酯共聚物材料較適合于hADSCs的生長和增殖,并可在材料上有效分化為內(nèi)皮細(xì)胞。③1和0.1μmol/LMT可以明顯促進(jìn)hADSCs向EC分化,其機(jī)制為通過促進(jìn)[Ca2+]i的增加,激活細(xì)胞分化過程中的ERK/MAPK信號通路。
【圖文】：

2.hA0scs的生物學(xué)性狀及接種率原代細(xì)胞在72h后貼壁，細(xì)胞如刷狀或旋渦狀生長(圖1)，原代培養(yǎng)30d左右時(shí)80%一90%鄉(xiāng)I!胞匯合，免疫表型表達(dá)為Co45(一)、Coi4(一)、eo44(+)、Co29(+)和CO105(+)。細(xì)胞容易成團(tuán)排列在材料[產(chǎn)仁長(圖2)，夕手且分布在材料不同層次的厚度土，因而使熒光產(chǎn)生不同的強(qiáng)度和清晰度。小孔徑材料上的細(xì)胞接種率98.3%士0.3%，，顯著高于大孔徑的90.3%士1.5%(P<0.05)。圖1月旨肪來源的間充質(zhì)「細(xì)胞原代 F191PrimaryeultureofhADSCs(只100)圖ZDAP一標(biāo)記不」lJ孔徑才」料巨hADSCs的細(xì)j泡核 F192hADSCsiabeledwithDAplonthedifferentaPertUresofpolv一￡一eaprolaetonematerials(又100)

3.掃描電鏡形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞接種于材料上72h后，細(xì)胞吸附于材料表面，細(xì)胞形態(tài)多呈長梭形，少數(shù)呈短梭形，細(xì)胞表面有微絨毛等突起，細(xì)胞跨越微孔表面或向孔內(nèi)生長(圖3)。小孔徑材料上的細(xì)胞較大孔徑的細(xì)胞數(shù)目明顯增多。圖3掃描電鏡觀察不同孔徑上的材料 Fig3hADSCsonthedifferentaPerturesobservedthroughscanningeIeetronmieroseoPe A.hADSCsonmaterialwithPorediameterof60~80pm(X200);B.hADSCsonmateriaIwithPorediameterof60一80 m(X500);C.hADSCsonmaterialwithPorediameterof180~200pm(義 200);D.hADSCsonmaterialwithPore diameterof180、200口 m(X500)4.增殖曲線的測定利用CCK一8法在24孔板內(nèi)連續(xù)7天檢測細(xì)胞在材料上的增殖情況。細(xì)胞在第3天進(jìn)入對數(shù)生長期。在起始細(xì)胞數(shù)目相同的條件下，自第2天起，小孔徑材料上的細(xì)胞增殖幅度大于大孔徑材料上的細(xì)胞(表1)。綜合細(xì)胞接種率結(jié)果說明:聚。一己內(nèi)酷生物材料材料更利于細(xì)胞的生長及增殖，但孔徑為60一80pm材料細(xì)胞負(fù)載量大于孔徑為180一200州m材料。因此，我們選用60一80尸m孔徑材料進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 姜紅梅,陳麗梅,;組織工程的進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).生物醫(yī)學(xué)工程分冊;1996年01期

2 李麗;于艷秋;;間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2009年03期

3 岳慧敏;張磊;王韞芳;梁峰;管利東;李紹青;閆舫;南雪;白慈賢;林峰;顏永年;裴雪濤;;人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在聚乳酸羥基乙酸材料上增殖及向內(nèi)皮細(xì)胞分化的研究[J];科學(xué)通報(bào);2006年10期

4 吳軍,王曉懷,楊德懋,楊太成,王捷,陳政良;鈣離子載體體外誘導(dǎo)外周血造血干細(xì)胞定向分化為成熟樹突狀細(xì)胞的研究[J];免疫學(xué)雜志;2005年01期

5 林本瑞;司忠義;;血管組織工程研究進(jìn)展[J];中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展;2006年06期

6 徐金會;褪黑激素的生物學(xué)作用[J];曲阜師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2002年03期

7 翟羽佳;仉紅剛;;脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化血管細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];中國生物工程雜志;2010年06期

8 李勤勞,劉敏,趙子劍;抗衰老激素的研究進(jìn)展[J];陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2004年02期

9 何蘭花;褪黑激素的研究進(jìn)展[J];動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué);2002年10期

10 侯慶普,周春陽;生物降解高分子材料的研究新進(jìn)展[J];現(xiàn)代化工;2000年12期

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