本文關(guān)鍵詞：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體MLPA診斷試劑盒初步研發(fā)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：神經(jīng)中樞系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)感染是臨床上常見疾病,由于其高致死率和產(chǎn)生嚴(yán)重后遺癥而倍受關(guān)注�？焖倜鞔_診斷是應(yīng)對臨床治療非常關(guān)鍵,但是,現(xiàn)有診斷技術(shù)不能達(dá)到此目的。本課題先總結(jié)了常見CNS感染病原物種類,接著針對神經(jīng)外科手術(shù)感染(Intracranial infection)17種常見細(xì)菌設(shè)計(jì)了一套MLPA探針。由于構(gòu)建MLPA探針?biāo)栀|(zhì)粒等關(guān)鍵試劑一直被荷蘭MRC-Holland公司壟斷,除了利用合成方法制備短探針外,我們不得不逐步探索一套MLPA長探針制備方法。首先我們使用M13噬菌體克隆了17種致病細(xì)菌的MLPA長探針,并把所得的M13噬菌體載體均通過了測序驗(yàn)證以保證這17個(gè)克隆載體均能夠用于制備MLPA探針,再通過Bsm I和Eco R V雙酶切法制備獲得長探針。該種探針制備方法使MLPA探針擴(kuò)大化生產(chǎn)變得簡單、快速,可以推廣到其他MLPA探針大量制備工藝中。在探針驗(yàn)證方面,我們克隆了17個(gè)陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒,這些質(zhì)粒各含有短探針和長探針DNA序列,經(jīng)過單靶點(diǎn)和多靶點(diǎn)PCR擴(kuò)增、ABI3500毛細(xì)電泳測試分析,證明我們制備的MLPA探針具備非常高的靈敏度和靶向性。課題預(yù)計(jì)僅用1 ml M13噬菌體衍生載體液體制備的探針便可滿足10萬次左右的MLPA反應(yīng),凸顯了MLPA的廉價(jià)性,也說明了MLPA診斷技術(shù)用于CNS感染病原體診斷有市場潛力。課題也做了探針質(zhì)量控制分析,為進(jìn)一步將探針研發(fā)成可以商品化的診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)�？傊�,所設(shè)計(jì)的MLPA試劑盒具有靈敏度高、快速、操作簡單、便宜等優(yōu)點(diǎn),對CNS感染病原菌診斷具有重要醫(yī)用潛力。本課題也同時(shí)設(shè)計(jì)了針對腦炎(Encephalitis)、腦膜炎(Cephalomeningitis)等非神經(jīng)外科手術(shù)(Craniotomy)后感染的病原體MLPA診斷探針。首先,為體現(xiàn)探針的可靠性和科學(xué)性我們爭取每一個(gè)靶位點(diǎn)找到相關(guān)的研究文獻(xiàn)數(shù)據(jù),其次,聯(lián)合使用Raw probe、MLPA Probe Verification和The mfold Web Server等生物信息學(xué)手段組裝探針和控制探針質(zhì)量參數(shù),最終得到的探針均達(dá)到MRC-Holland公司提出的MLPA探針設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。但是研究生學(xué)習(xí)時(shí)間緊迫未能進(jìn)行探針克隆等相關(guān)試劑盒研發(fā)。
【關(guān)鍵詞】：中樞神經(jīng)感染 致病微生物 診斷試劑盒 MLPA 探針制備 M13噬菌體質(zhì)粒
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 引言10-22
• 1.1 CNS感染簡介10
• 1.2 CNS感染病原學(xué)特征簡介10-17
• 1.2.1 病毒性腦炎及流行病學(xué)特征11-13
• 1.2.2 細(xì)菌感染病原學(xué)特征及ICI病原學(xué)簡介13-16
• 1.2.3 其他病原體16-17
• 1.3 CNS感染診斷方法17-18
• 1.3.1 CNS感染病原體傳統(tǒng)診斷方法17-18
• 1.3.2 分子檢測技術(shù)18
• 1.4 研究方案簡介18-21
• 1.4.1 MLPA技術(shù)簡介18-19
• 1.4.2 MLPA技術(shù)原理19-20
• 1.4.3 MLPA技術(shù)特點(diǎn)20-21
• 1.4.4 MLPA技術(shù)應(yīng)用21
• 1.5 課題研究內(nèi)容和意義21-22
• 第2章 第CNS感染病原體MLPA探針設(shè)計(jì)22-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)工具和設(shè)計(jì)原則22-23
• 2.1.1 探針設(shè)計(jì)需要的軟件和資料22-23
• 2.1.2 MLPA探針設(shè)計(jì)基本原則和需要注意的關(guān)鍵部分23
• 2.2 MLPA探針設(shè)計(jì)步驟和流程23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析24-28
• 2.3.1 CNS病原體及其靶序列24-27
• 2.3.2 CNS設(shè)計(jì)探針27-28
• 第3章 ICI原體感染MLPA探針分子克隆28-61
• 3.1 實(shí)驗(yàn)耗材、試劑及儀器29-33
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料29
• 3.1.2 化學(xué)試劑及耗材29-31
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器31-32
• 3.1.5 常用試劑配制32-33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟33-42
• 3.2.1 雄性大腸桿菌JM109篩選與宿主菌制備33-34
• 3.2.2 藍(lán)白斑篩選法獲得重組M13噬菌體與懸濁液制備34-40
• 3.2.3 重組噬菌體液體培養(yǎng)與原種制備40
• 3.2.4 M13-dsDNA制備與測序驗(yàn)證40-42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析42-57
• 3.3.1 雄性大腸桿菌JM109篩選與宿主菌制備42-43
• 3.3.2 藍(lán)白斑篩選法獲得重組M13噬菌體與懸濁液制備P C R結(jié) 果與分析 .. 343.3.3 雙鏈D N A制 備P C R結(jié) 果驗(yàn)證與送測序分析43-57
• 3.4 討論57-59
• 3.4.1 宿主菌對實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)影響57-58
• 3.4.2 藍(lán)白斑篩選陽性克隆與懸濁液制備58-59
• 3.4.3 重組噬菌體測序驗(yàn)證59
• 3.5 本章小結(jié)59-61
• 第4章 MLPA技術(shù)診斷神經(jīng)外科病原體方法學(xué)建立61-89
• 4.1 實(shí)驗(yàn)耗材、試劑及儀器61-63
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料61
• 4.1.2 化學(xué)試劑及耗材61-62
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器62-63
• 4.1.4 常用試劑配制63
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟63-72
• 4.2.1 重組M13噬菌體單鏈DNA制備63-64
• 4.2.2 MLPA探針的制備64-67
• 4.2.3 MLPA探針診斷病原體方法學(xué)初步探究67-71
• 4.2.4 部分探針質(zhì)量初步驗(yàn)證71-72
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析72-86
• 4.3.1 制備探針的單鏈DNA制備結(jié)果與分析72-73
• 4.3.2 MLPA方法學(xué)診斷結(jié)果與分析73-83
• 4.3.3 部分探針質(zhì)量驗(yàn)證結(jié)果與分析83-86
• 4.4 討論86-87
• 4.5 本章小結(jié)87-89
• 第5章 結(jié)論89-91
• 5.1 文章研究成果小結(jié)89
• 5.2 需要進(jìn)一步完善工作89-91
• 參考文獻(xiàn)91-101
• 致謝101-103
• 附件A103-111
• 附件B111-121
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究結(jié)果121

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 茆海豐;劉洪書;趙勇;營麗娟;;醫(yī)院感染的金黃色葡萄球菌耐藥性與耐藥基因檢測[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2007年07期

2 張星虎;;中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原學(xué)診斷[J];中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2011年06期

  本文關(guān)鍵詞：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體MLPA診斷試劑盒初步研發(fā)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：254153