【摘要】：手足口病(Hand foot and mouth disease, HFMD)是一種常見(jiàn)的傳播途徑復(fù)雜、傳染性較強(qiáng)、在短時(shí)間內(nèi)可造成大規(guī)模流行的病毒感染性疾病,柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA16)是其主要病原體之一,感染率常常超過(guò)感染總?cè)藬?shù)的60%,至今還沒(méi)有十分安全有效的疫苗和特效藥來(lái)預(yù)防和治療CA16感染。因此,研制出安全、有效的CA16疫苗對(duì)于手足口病的預(yù)防和控制至關(guān)重要。本課題從糞便中分離CA16,用現(xiàn)代化微載體技術(shù)制備CA16滅活疫苗,免疫小鼠,并對(duì)其免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià),為疫苗的研制提供了研究基礎(chǔ)。 本研究工作包括4個(gè)部分：(1)CA16的分離、鑒定；(2)CA16生物學(xué)特性研究；(3)微載體培養(yǎng)CA16并純化；(4)CA16全病毒滅活疫苗的免疫原性檢測(cè)。 (1)CA16的分離、鑒定 本研究選用Vero細(xì)胞從臨床標(biāo)本中分離腸道病毒,并用RT-PCR初步鑒定是否含有CA16,將從編號(hào)為DC1的標(biāo)本中分離到的野毒株經(jīng)過(guò)三輪蝕斑篩選后形成大小均一的空斑,挑取單克隆,并放大培養(yǎng)至第7代(DC1P7),經(jīng)RT-PCR、測(cè)序、電鏡觀察、免疫熒光等證明DC1P7為CA16,同時(shí)對(duì)本次分離的CA16VP1區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,判定該CA16毒株屬于B2a亞型。 (2)CA16生物學(xué)特性研究 為了后期規(guī)�；囵B(yǎng)CA16并純化,首先對(duì)與此相關(guān)的CA16生物學(xué)特性進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①培養(yǎng)基中小牛血清濃度和pH對(duì)病毒的增殖有重要影響：選用GlBCO公司的DMEM培養(yǎng)基,無(wú)血清培養(yǎng)96h后CA16幾乎不病變或病變異常,血清濃度0.5%-2.5%時(shí)似乎隨著血清濃度的增加病變率增加；②培養(yǎng)基中NaHCO3濃度為0.165%左右時(shí)CA16增殖最快；③PEG沉淀和氯仿抽提對(duì)病毒滴度損失較大,且純化效果不佳,不能用于后期抗原的純化。④CA16在增殖過(guò)程中一部分釋放到培養(yǎng)液上清,但主要存在于細(xì)胞內(nèi)；⑤CA16對(duì)高溫敏感,-20℃以下可長(zhǎng)期保存。 (3)微載體規(guī)模化培養(yǎng)CA16并純化 本實(shí)驗(yàn)中使用濃度為3g/L微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞和制備大量CA16, Vero細(xì)胞在微載體上培養(yǎng)5～7天長(zhǎng)成單層,接種適量CA16病毒液至微載體上單層Vero細(xì)胞,72h后CPE達(dá)80%以上,收毒,感染滴度約3.56×1010TCID50/ml,經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后出現(xiàn)清晰灰白條帶,在電鏡下檢測(cè)發(fā)現(xiàn)45%-60%蔗糖區(qū)間帶和45%蔗糖帶中有較多CA16病毒顆粒,且較純。 (4)CA16全病毒滅活疫苗的免疫原性檢測(cè) 將經(jīng)蔗糖密度梯度離心初步純化的CA16抗原吸出、透析除去蔗糖并濃縮,用β-丙內(nèi)酯滅活后與A1(OH)3佐劑一起免疫動(dòng)物,以免疫劑量8.6×104TCID50/只,分0,2,4周免疫三次,結(jié)果顯示：本實(shí)驗(yàn)制備的CA16全病毒滅活疫苗具有較好的免疫原性,血清IgG抗體和中和抗體效價(jià)峰值分別達(dá)1:512、1:128,GMT分別為1：161.27、1：73.52。 本論文成功地應(yīng)用Vero細(xì)胞分離出CA16,并對(duì)其相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行研究,采用微載體培養(yǎng)技術(shù)制備的CA16全病毒滅活疫苗具有較好的免疫原性,為疫苗的研制提供了研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2536646