【摘要】：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)是存在于骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中的一種組織干細(xì)胞。由于其具有多向分化潛能和低免疫原性而被作為種子細(xì)胞廣泛應(yīng)用于組織工程,特別是骨組織工程。多種誘因可以誘導(dǎo)hMSCs向成骨細(xì)胞分化,如激素、機(jī)械力學(xué)刺激、細(xì)胞因子等。體內(nèi)骨組織中的組織間隙液能對(duì)骨生成細(xì)胞產(chǎn)生流體剪切力(fluid shear stress, FS S),這種流體剪切力能促進(jìn)骨生成細(xì)胞的增殖和分化,對(duì)于骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育和正常形態(tài)功能的維持非常重要。因此,人們?cè)谶M(jìn)行組織工程骨的研究過(guò)程中,利用生物反應(yīng)器模擬體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生FSS作用于體外培養(yǎng)的hMSCs,以此促進(jìn)組織工程骨的生成。盡管已有研究證明FSS能促進(jìn)hMSCs向成骨細(xì)胞分化。但是關(guān)于FSS促進(jìn)hMSCc成骨分化的機(jī)理目前還尚不完全清楚。 在本項(xiàng)研究中我們利用灌流培養(yǎng)體系產(chǎn)生FSS作用于接種在多孔隙PLGA-3D支架上的hMSCs,研究FSS對(duì)hMSCs分化的影響及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。主要包括以下三個(gè)部分：第一部分：檢測(cè)了4.2dynes/cm2間歇性FSS、4.2dynes/cm2持續(xù)性FSS和0.34dynes/cm2的FSS三種不同的FSS對(duì)hMSCs成骨分化的影響,并且檢驗(yàn)了ERK1/2在FSS促進(jìn)hMSCs成骨分化的過(guò)程中的作用以及三種不同F(xiàn)SS對(duì)ERK1/2活性的影響。利用RT-PCR檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下hMSCs內(nèi)ALP、COLIα、OCN和Runx2等與成骨分化相關(guān)的特異基因的表達(dá)情況,采用改良鈣鈷染色和ALP活性檢測(cè)試劑盒分別進(jìn)行定性和定量分析不同F(xiàn)SS對(duì)hMSCs的ALP活性的影響。采用Western-blot檢測(cè)ERK1/2的磷酸化水平。并且檢測(cè)在用PD98059抑制ERK1/2活性的基礎(chǔ)上,FSS對(duì)各成骨分化特異性基因的表達(dá)和ALP活性的影響。結(jié)果表明4.2dynes/cm2間歇性FSS能有效地促進(jìn)hMSCs向成骨細(xì)胞分化,而4.2dynes/cm持續(xù)性FSS和0.34dynes/cm2的FSS對(duì)hMSCs沒(méi)有明顯的誘導(dǎo)分化作用,并且4.2dynes/cm2間歇性FSS較其他兩種FSS能更有效地提高ERK1/2的活性。同時(shí)我們的實(shí)驗(yàn)還證明了ERK1/2在FSS促進(jìn)hMSCs成骨分化的過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。 第二部分：主要驗(yàn)證了β1整合素是否在FSS促進(jìn)hMSCS成骨分化的過(guò)程中充當(dāng)力學(xué)受體感受力學(xué)刺激以及FSS所引起的ERK1/2活化是否通過(guò)提高Runx2轉(zhuǎn)錄活性而調(diào)節(jié)與成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)。采用western-blot檢測(cè)在FSS作用下,hMSCs內(nèi)ERK1/2、pi整合素和FAK等的活化情況或蛋白水平,利用免疫共沉淀檢測(cè)了FSS對(duì)Runx2的酪氨酸磷酸化水平的影響,并且檢測(cè)了在用小分子多肽RGDS特異性阻斷β1整合素和胞外基質(zhì)之間的連接后,FSS對(duì)FAK和ERK1/2的活性的影響。最后檢測(cè)在用PD98059抑制ERK1/2活性后,FSS對(duì)Runx2的磷酸化水平和β1整合素的表達(dá)的影響。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)在FSS的作用下細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2、FAK和Runx2磷酸化水平顯著升高,β1整合素的表達(dá)水平也顯著升高。而用小分子多肽RGDS特異性阻斷β1整合素后,FSS未能引起的ERK1/2和FAK的磷酸化水平升高。并且經(jīng)PD98059處理后,FSS亦未能提高Runx2的活性和上調(diào)β1整合素的表達(dá)。以上結(jié)果表明在FSS促進(jìn)hMSCs成骨分化的過(guò)程中,FSS所引起的ERK1/2和FAK活化依賴β1整合素感受力學(xué)刺激,活化的ERK1/2不僅能通過(guò)提高Runx2的轉(zhuǎn)錄活性而啟動(dòng)與成骨分化相關(guān)的基因表達(dá),還能反饋調(diào)節(jié)β1整合素的表達(dá)。 第三部分：在第一、二部分研究中,我們發(fā)現(xiàn)ERK1/2對(duì)因FSS引起的Runx2和p1整合素表達(dá)升高具有重要的調(diào)節(jié)作用,但是ERK1/2是通過(guò)那些信號(hào)途徑來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)的呢?目前還尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。由于BMPs/Smadl/5/8信號(hào)通路是調(diào)節(jié)Runx2表達(dá)的重要信號(hào)通路,而NFkB已被證明是調(diào)節(jié)BMP2、BMP4和β1整合素表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。我們猜測(cè)FSS引起的ERK1/2活化可能通過(guò)提高NFkB轉(zhuǎn)錄活性而上調(diào)節(jié)β1整合素和BMP2、BMP4表達(dá),再通過(guò)活化BMPs/Smadl/5/8信號(hào)通路而調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)。為了驗(yàn)證以上猜測(cè),我們分別采用RT-PCR和Western-blot檢測(cè)了FSS對(duì)hMSCs內(nèi)的BMP2和BMP4表達(dá)以及對(duì)Smadl/5/8活性的影響,并且在用人重組noggin蛋白阻斷BMPs/Smad1/5/8信號(hào)通路后檢測(cè)FSS對(duì)Runx2表達(dá)和Smad1/5/8活性的影響。其次用Western-blot和免疫熒光染色分別檢測(cè)了FSS對(duì)NFkB活性和核轉(zhuǎn)移的影響,并且檢測(cè)在用BAY11-7082抑制NFkB核轉(zhuǎn)移后,FSS對(duì)BMP2、BMP4、Runx2和β1整合素表達(dá)的影響以及對(duì)Smad1/5/8活性的影響。最后采用PD98059抑制ERK1/2活性后檢測(cè)FSS對(duì)NFkB和Smad1/5/8活性的影響以及對(duì)BMP2和BMP4表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSS能使hMSCs內(nèi)的BMP2和BMP4的mRNA水平和Smad1/5/8活性顯著升高,經(jīng)noggin處理后,FSS未能使hMSCs內(nèi)的Runx2表達(dá)水平和Smadl/5/8的升高。此外,FSS能使p65NFkB的活性和核轉(zhuǎn)移率顯著升高,而抑制NFkB核轉(zhuǎn)移后,FSS所引起的β1整合素、Runx2、BMP2和BMP4表達(dá)以及Smadl/5/8的磷酸化也受到抑制。PD98059不僅能抑制FSS所導(dǎo)致的p65NFkB活化和核轉(zhuǎn)移還能抑制FSS所引起的BMP2和BMP4的表達(dá)以及Smad1/5/8活化。以上結(jié)果表明在FSS影響hMSCs成骨分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中,ERK1/2能通過(guò)調(diào)節(jié)NFkB的轉(zhuǎn)錄活性而影響β1整合素和BMPs的表達(dá),BMPs進(jìn)而影響Smadl/5/8的活化,調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá),ERK1/2在該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中起著非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。 本項(xiàng)研究不僅驗(yàn)證了間歇性FSS較持續(xù)性FSS能有效地促進(jìn)hMSCs向成骨細(xì)胞分化,而且證明了在FSS促進(jìn)hMSCs成骨分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中,D1整合素感受FSS所產(chǎn)生的力學(xué)刺激進(jìn)而引起ERK1/2活化,活化的ERK1/2既能通過(guò)提高Runx2的轉(zhuǎn)錄活性而啟動(dòng)與成骨分化相關(guān)基因的表達(dá),又能通過(guò)調(diào)節(jié)NFkB活性調(diào)節(jié)β1整合素和BMPs的表達(dá),再通過(guò)BMPs/Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)。本研究為闡明FSS促進(jìn)hMSCs成骨分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供了重要信息,對(duì)于骨組織工程的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2536569