【摘要】：目的:用三種方法將MS2噬菌體生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的大腸桿菌的核酸、細(xì)胞器、細(xì)胞碎片、化學(xué)試劑等去除掉,純化MS2噬菌體,同時(shí)比較三種純化方法的優(yōu)劣;分別用四種方法去除MS2噬菌體中混有的大量核酸,使MS2噬菌體達(dá)到內(nèi)參照品的要求,同時(shí)比較四種方法的優(yōu)劣。 方法:含有大量雜質(zhì)的MS2噬菌體用三種方法進(jìn)行純化,超速離心法、三氯甲烷抽提法、分子篩法,比較三種方法的優(yōu)劣性;分別應(yīng)用酶消化法、無(wú)限稀釋和透析綜合法、超速離心法、Millipore柱子法四種方法去除MS2噬菌體中混有的大量核酸。 結(jié)果:用三種不同的方法純化MS2噬菌體。超速離心法:電泳分析圖可見(jiàn),處理后的樣本電泳條帶亮度高,但有拖尾現(xiàn)象,且通過(guò)電鏡分析可知,背景純度不高,且含有大量的雜質(zhì)。三氯甲烷法:電泳分析圖可見(jiàn),處理后的樣本電泳條帶亮度高,無(wú)拖尾現(xiàn)象,且通過(guò)電鏡分析可知,背景純度高,不含有雜質(zhì),但通過(guò)SDS-PAGE分析圖可見(jiàn)樣本中卻有少量的雜蛋白殘留。分子篩法:通過(guò)SDS-PAGE分析圖可知,處理后的樣本無(wú)雜蛋白殘留,只含有14KD的MS2噬菌體單體。 用四種不同的方法去除MS2噬菌體中混有的大量核酸。酶消化法:通過(guò)柱狀分析圖可知應(yīng)用50U、25U、12.5U、2.5U的酶濃度,其CT值相差不多,也就是說(shuō)DNA模板量相差不多。無(wú)限稀釋和透析綜合法:通過(guò)PCR分析圖得知,隨著稀釋度的增加,透析前后的樣本之間只有些微的差異,且通過(guò)電泳分析也可得知,隨著稀釋度從10-2至10-7的增加,電泳條帶亮度相差不多,且透析前后的電泳條帶亮度也相差不多,加核酸酶與不加核酸酶處理的電泳條帶亮度也是相差不多,通過(guò)電鏡觀察可知,透析后的MS2噬菌體中混有大量的化學(xué)試劑的結(jié)晶,掩蓋了大量的MS2噬菌體。超速離心法:通過(guò)PCR產(chǎn)物電泳圖可知,第七次離心后沉淀中殘留的DNA于25個(gè)循環(huán)時(shí)才出現(xiàn),且消化掉DNA的影響后,RNA既MS2噬菌體的量仍較大。然而通過(guò)Real Time PCR精確定量后,每一次離心后沉淀和上清中的噬菌體和殘留核酸的量相差不多,且每離心一次大約損失10倍的噬菌體。Millipore柱子法:通過(guò)PCR產(chǎn)物電泳圖可知,PBS Buffer組和Bezonase Buffer組在25個(gè)循環(huán)時(shí)才有少量的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,Bezonase Buffer組的電泳條帶亮度較PBS Buffer組亮度高,且通過(guò)RT-PCR檢測(cè),PBS Buffer組MS2噬菌體與殘留核酸之間的絕對(duì)定量相差4個(gè)數(shù)量級(jí),而B(niǎo)ezonase Buffer組MS2噬菌體與殘留核酸之間的絕對(duì)定量只相差3個(gè)數(shù)量級(jí),然而通過(guò)電鏡觀察,Bezonase Buffer組的樣本背景較純,而PBS Buffer組的樣本背景跟前者相比較差,但兩者都較未過(guò)Millipore柱子的樣本背景純度高。 結(jié)論:用三種不同的方法純化MS2噬菌體,三氯甲烷抽提的方法最好;用四種不同的方法去除殘留的核酸,過(guò)Millipore柱子法最好。
【圖文】：

圖一 酶切后電泳分析圖2 去除 MS2 噬菌體中混有的核酸2.1 酶濃度法四種不同酶濃度 50U，25U，12.5U，2.5UPCR 檢測(cè)其 CT 值，通過(guò)下圖可知，各個(gè)量相差不多，應(yīng)用高濃度的酶濃度消化掉種方式不能完全去除 DNA 殘留。核酸酶處理后EV71 P-F25303540TCalveu

26圖十一 上清中的絕對(duì)定量分析圖2.4 Millipore 柱子法通過(guò)圖十二可知，在 25 個(gè)循環(huán)時(shí)才出現(xiàn)電泳條帶，既有的 DNA 模板進(jìn)行擴(kuò)Bezonase Buffer 組的電泳條帶亮度較 PBS 組亮度高，說(shuō)明 Bezonase Buffer 組的
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：2534925