【摘要】：目的:用三種方法將MS2噬菌體生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大腸桿菌的核酸、細胞器、細胞碎片、化學(xué)試劑等去除掉,純化MS2噬菌體,同時比較三種純化方法的優(yōu)劣;分別用四種方法去除MS2噬菌體中混有的大量核酸,使MS2噬菌體達到內(nèi)參照品的要求,同時比較四種方法的優(yōu)劣。 方法:含有大量雜質(zhì)的MS2噬菌體用三種方法進行純化,超速離心法、三氯甲烷抽提法、分子篩法,比較三種方法的優(yōu)劣性;分別應(yīng)用酶消化法、無限稀釋和透析綜合法、超速離心法、Millipore柱子法四種方法去除MS2噬菌體中混有的大量核酸。 結(jié)果:用三種不同的方法純化MS2噬菌體。超速離心法:電泳分析圖可見,處理后的樣本電泳條帶亮度高,但有拖尾現(xiàn)象,且通過電鏡分析可知,背景純度不高,且含有大量的雜質(zhì)。三氯甲烷法:電泳分析圖可見,處理后的樣本電泳條帶亮度高,無拖尾現(xiàn)象,且通過電鏡分析可知,背景純度高,不含有雜質(zhì),但通過SDS-PAGE分析圖可見樣本中卻有少量的雜蛋白殘留。分子篩法:通過SDS-PAGE分析圖可知,處理后的樣本無雜蛋白殘留,只含有14KD的MS2噬菌體單體。 用四種不同的方法去除MS2噬菌體中混有的大量核酸。酶消化法:通過柱狀分析圖可知應(yīng)用50U、25U、12.5U、2.5U的酶濃度,其CT值相差不多,也就是說DNA模板量相差不多。無限稀釋和透析綜合法:通過PCR分析圖得知,隨著稀釋度的增加,透析前后的樣本之間只有些微的差異,且通過電泳分析也可得知,隨著稀釋度從10-2至10-7的增加,電泳條帶亮度相差不多,且透析前后的電泳條帶亮度也相差不多,加核酸酶與不加核酸酶處理的電泳條帶亮度也是相差不多,通過電鏡觀察可知,透析后的MS2噬菌體中混有大量的化學(xué)試劑的結(jié)晶,掩蓋了大量的MS2噬菌體。超速離心法:通過PCR產(chǎn)物電泳圖可知,第七次離心后沉淀中殘留的DNA于25個循環(huán)時才出現(xiàn),且消化掉DNA的影響后,RNA既MS2噬菌體的量仍較大。然而通過Real Time PCR精確定量后,每一次離心后沉淀和上清中的噬菌體和殘留核酸的量相差不多,且每離心一次大約損失10倍的噬菌體。Millipore柱子法:通過PCR產(chǎn)物電泳圖可知,PBS Buffer組和Bezonase Buffer組在25個循環(huán)時才有少量的DNA模板進行擴增,Bezonase Buffer組的電泳條帶亮度較PBS Buffer組亮度高,且通過RT-PCR檢測,PBS Buffer組MS2噬菌體與殘留核酸之間的絕對定量相差4個數(shù)量級,而Bezonase Buffer組MS2噬菌體與殘留核酸之間的絕對定量只相差3個數(shù)量級,然而通過電鏡觀察,Bezonase Buffer組的樣本背景較純,而PBS Buffer組的樣本背景跟前者相比較差,但兩者都較未過Millipore柱子的樣本背景純度高。 結(jié)論:用三種不同的方法純化MS2噬菌體,三氯甲烷抽提的方法最好;用四種不同的方法去除殘留的核酸,過Millipore柱子法最好。
【圖文】：

圖一 酶切后電泳分析圖2 去除 MS2 噬菌體中混有的核酸2.1 酶濃度法四種不同酶濃度 50U，25U，12.5U，2.5UPCR 檢測其 CT 值，通過下圖可知，各個量相差不多，應(yīng)用高濃度的酶濃度消化掉種方式不能完全去除 DNA 殘留。核酸酶處理后EV71 P-F25303540TCalveu

26圖十一 上清中的絕對定量分析圖2.4 Millipore 柱子法通過圖十二可知，在 25 個循環(huán)時才出現(xiàn)電泳條帶，既有的 DNA 模板進行擴Bezonase Buffer 組的電泳條帶亮度較 PBS 組亮度高，說明 Bezonase Buffer 組的
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 顧敬敏;韓文瑜;路榮;雷連成;楊勇軍;馮新;孫長江;杜崇濤;;治療細菌性疾病的有力武器——噬菌體及其裂解酶[J];河北科技師范學(xué)院學(xué)報;2011年01期

2 方圓子;王琰;孫建和;;豬鏈球菌噬菌體SMP裂解酶在乳酸乳球菌中的表達及活性研究[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)科學(xué)版);2011年03期

3 劉斌;JOST Günter;SCHMIEL Juliane;WOLF Arite;黃翔玲;谷力;王玉橋;葉德贊;;源于克雷伯氏菌Klebsiella sp. AC-11的3株噬菌體的生物學(xué)特性[J];海洋學(xué)報(中文版);2011年04期

4 ;Nature Biotechnology導(dǎo)讀[J];生物技術(shù)進展;2011年02期

5 ;噬菌體:細菌的天敵[J];養(yǎng)豬;2011年04期

6 王海漩;烏美妮;湯洋;李建芳;李彥涵;胡云章;趙蕊蕊;沈霏;段志青;胡凝珠;;廣譜流感噬菌體微球疫苗對豚鼠的免疫保護作用[J];中國生物制品學(xué)雜志;2011年08期

7 李翠英;;最小生命體——病毒[J];農(nóng)藥市場信息;2011年20期

8 於劍;密金玲;艾必燕;黃家政;聶奎;;大腸桿菌菌蛻制備的初步研究[J];重慶中草藥研究;2011年01期

9 朱大強;李存;陳斌;姜煥煥;江曉芳;安小平;米志強;陳禹保;童貽剛;;四種常用高通量測序拼接軟件的應(yīng)用比較[J];生物信息學(xué);2011年02期

10 沈定樹;余方友;;腸出血性大腸埃希菌O157:H7及其質(zhì)粒O157的研究進展[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2011年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 宗憲磊;姜篤銀;付小兵;單菲;;KGF噬菌體模擬肽促進表皮細胞增殖的實驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會燒傷外科學(xué)分會2009年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

2 宗憲磊;蔡景龍;陳瑩;姜篤銀;;應(yīng)用噬菌體隨機12肽庫篩選TβRII特異性序列[A];第七屆中國醫(yī)師協(xié)會美容與整形醫(yī)師大會論文集[C];2010年

3 羅永艾;;噬菌體技術(shù)在結(jié)核病診治中的應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會2008年全國結(jié)核病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

4 劉振中;宗憲磊;姜篤銀;;TGF-beta1噬菌體模擬肽抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞活性的實驗研究[A];急慢性創(chuàng)面治療新技術(shù)專題系列研討會之感染創(chuàng)面綜合治療論壇論文匯編[C];2011年

5 周瑩冰;申曉冬;李明;黃建軍;胡曉梅;饒賢才;胡福泉;;銅綠假單胞茵噬菌體PaP3生物學(xué)特性的研究[A];2006中國微生物學(xué)會第九次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

6 朱軍民;熊坤;陳瑤;胡珍;譚銀玲;叢延廣;陳志瑾;饒賢才;胡福泉;;摩氏摩根菌噬菌體MmP1生物學(xué)特性及其基因組學(xué)的研究[A];重慶微生物學(xué)會第九屆會員代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2009年

7 梁耀斌;鄺小佳;;噬菌體生物擴增法對結(jié)核滲出性胸膜炎的診斷價值應(yīng)用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會2006年學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

8 王凌;閉蘭;張愛華;;用噬菌體隨機7肽庫篩選WuT4單抗人CD4 B細胞抗原表位[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

9 姜篤銀;宗憲磊;付小兵;單菲;;TGF-β1噬菌體模擬肽抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的實驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會燒傷外科學(xué)分會2009年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

10 譚銀玲;李明;黃建軍;饒賢才;朱軍民;胡福泉;;難測序噬菌體基因組PaP1的鳥槍法測序及其面臨的困難[A];第四屆全國燒傷救治專題研討會燒傷感染救治新進展論文匯編[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 欒海;殺菌自有噬菌體[N];新華每日電訊;2001年

2 徐錚奎;噬菌體——未來的新型“抗生素”[N];中國醫(yī)藥報;2001年

3 陳潔 譯;噬菌體 對付耐藥菌新武器[N];中國醫(yī)藥報;2002年

4 蒲昭和;噬菌體制服病菌的新武器[N];中國中醫(yī)藥報;2004年

5 劉霞;噬菌體讓生物分子進化增速100倍[N];科技日報;2011年

6 ;噬菌體：制服病菌新武器[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2001年

7 記者 劉霞;科學(xué)家改造噬菌體提升抗生素藥效[N];科技日報;2009年

8 湖北 任珩;讓你的上網(wǎng)賬號高枕無憂[N];電腦報;2003年

9 本報特約撰稿人 陸志城;吃掉細菌[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2004年

10 勞英堅;解決細菌抗藥大有希望[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 謝瓊慧;MiR-192通過靶向ERCC3、ERCC4蛋白表達抑制2.2.15細胞的核酸剪切修復(fù)[D];華中科技大學(xué);2011年

2 孫衛(wèi)忠;銅綠假單胞菌噬菌體elys基因推定及功能驗證[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

3 張立群;核酸氧化抑制基因NUDT5在細胞周期調(diào)控及老化中的作用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

4 楊琦;蚯蚓組織中一組核酸酶酶學(xué)、生物學(xué)作用及其機制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2007年

5 蒲穎;高胰島素處理相關(guān)核酸適體的篩選及基于核酸適體技術(shù)的胰島素檢測[D];中南大學(xué);2011年

6 薛慶旺;基于熒光信號放大技術(shù)的蛋白質(zhì)和核酸檢測方法研究[D];山東大學(xué);2012年

7 陳昭斌;噬菌體作用指示病毒用于消毒效果評價的研究[D];四川大學(xué);2006年

8 謝軼;銅綠假單胞菌噬菌體、QS系統(tǒng)與生物被膜的相關(guān)研究[D];四川大學(xué);2006年

9 牛冬燕;應(yīng)用噬菌體控制牛及其飼養(yǎng)環(huán)境中大腸桿菌O157：H7的研究[D];大連理工大學(xué);2009年

10 閆東梅;利用噬菌體肽庫篩選PGE_2受體拮抗劑以及合成肽的抗炎作用及機制研究[D];吉林大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 徐純瓊;MS2噬菌體的純化和殘留核酸的去除研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2011年

2 孫晨虎;基于功能型核酸的電化學(xué)生物傳感器研究[D];湖南大學(xué);2010年

3 許國峰;核酸酶Onconase抗腫瘤研究[D];浙江大學(xué);2004年

4 王靜;L-苯丙氨酸發(fā)酵條件的優(yōu)化與控制[D];江南大學(xué);2011年

5 馮美娟;鎖核酸電化學(xué)傳感器在急性早幼粒細胞白血病實際樣品檢測中的影響因素分析及應(yīng)用研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

6 李俊;小鼠SN、NSN卵體外成熟與核酸酶敏感性變化研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

7 沈俊杰;“細菌—噬菌體”聯(lián)合生物計算機的研究[D];浙江大學(xué);2005年

8 王小海;提高轉(zhuǎn)基因動物基因打靶效率的鋅指核酸酶技術(shù)體系的建立[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

9 秦成峰;登革病毒衣殼蛋白靶向抗病毒作用的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

10 劉鵬;噬菌體裂解法快速檢測結(jié)核分枝桿菌應(yīng)用的研究[D];吉林大學(xué);2008年

，

本文編號：2534925