【摘要】：以腫瘤靶向治療為目標(biāo),單鏈抗體為研究對象,紅細(xì)胞膜為例,構(gòu)建利用噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)針對腫瘤細(xì)胞表面抗原的特異性單鏈抗體的方法。第一步為構(gòu)建人源噬菌體單鏈抗體庫,第二步為利用紅細(xì)胞膜為抗原,進(jìn)行噬菌體單鏈抗體庫的淘洗,篩選能特異結(jié)合紅細(xì)胞膜的單鏈抗體。 單鏈抗體由以一段彈性連接鏈(Linker)相連的抗體重鏈可變區(qū)基因(VH)與輕鏈可變區(qū)基因(VL)組成。為獲取VH和VL基因,首先利用淋巴細(xì)胞分離液分離健康人O型外周血中的淋巴細(xì)胞,提取RNA再反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以此作為PCR擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因的模板；設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增VH和VL基因的引物共31條,并在引物中設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)便于進(jìn)行克隆和鑒定。通過75個(gè)引物相互配對的PCR反應(yīng),擴(kuò)增獲得了包含個(gè)體基本所有的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因。設(shè)計(jì)單鏈抗體以VH-Linker-VL構(gòu)型與噬菌粒載體pFAB相連,Linker序列為易折疊的(GGGGS)3序列。在構(gòu)建pFAB-VH-Linker-VL重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,通過添加新酶切位點(diǎn)和移碼突變構(gòu)建pFAB-BXM重組質(zhì)粒,以此為載體,將之前擴(kuò)增的VH基因和VL基因分別插入其中,構(gòu)建重鏈抗體庫和輕鏈抗體庫。最后,通過PCR擴(kuò)增出重鏈抗體庫中VH片段,插入輕鏈抗體庫中,獲得庫容量約為4×106人源噬菌體單鏈抗體庫。 在完成構(gòu)建人源噬菌體單鏈抗體庫的基礎(chǔ)上,利用紅細(xì)胞膜為抗原,篩選特異性結(jié)合細(xì)胞膜表面抗原的單鏈抗體。首先,利用抗A、B血型定型試劑對包被后的紅細(xì)胞膜的抗原活性進(jìn)行檢測,確定經(jīng)低滲及超聲處理后的紅細(xì)胞膜有血型抗原的活性且成功包被于ELISA板上。在篩選前對洗滌條件進(jìn)行摸索,首先檢測不同濃度Tween洗滌對紅細(xì)胞膜活性的影響,發(fā)現(xiàn)0.1%及以下濃度PBST (PBS+0.1%Tween)對紅細(xì)胞膜抗原活性無影響。然后,摸索淘洗噬菌體單鏈抗體庫的洗滌條件,發(fā)現(xiàn)Tween洗滌能力過強(qiáng),造成一些可能是特異性結(jié)合、但親和力低的單鏈抗體噬菌體被洗脫,故淘洗時(shí)用沒有Tween的PBS洗滌即可。最后,將A、B兩種紅細(xì)胞膜分別包被于ELISA板上,經(jīng)1%BSA封閉后,第一輪加入1011噬菌體,第二輪加入1010,第三、四輪加入108,第五、六輪加入107,經(jīng)PBS洗滌10遍后,利用0.2M Gly-HCl(pH2.2)洗脫,再侵染大腸桿菌XL1-Blue,獲得能結(jié)合紅細(xì)胞膜抗原的單鏈抗體噬菌體。經(jīng)六輪淘洗,結(jié)合A、B紅細(xì)胞膜的噬菌體均有所富集,并篩選出一些親和力比較高的噬菌體。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 郭建巍;新型小分子抗體scFv多聚體與腫瘤靶向[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2003年02期

2 盛唯瑾;苗慶芳;甄永蘇;;抗表皮生長因子受體噬菌體抗體庫的構(gòu)建篩選及單鏈抗體可溶性表達(dá)[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2009年06期

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本文編號：2534805