本文關(guān)鍵詞：G蛋白偶聯(lián)受體激酶6同源二聚化的機(jī)制及其對(duì)胞膜定位的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinases,GRKS)通過(guò)特異性地磷酸化配體激活的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors,GPCRS),快速“關(guān)閉”或“減敏(desensitization)”激動(dòng)劑持續(xù)引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo),從而調(diào)控GPCR介導(dǎo)的各種生理病理活動(dòng)。GRK6屬于GRK4亞家族成員,在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能代謝以及神經(jīng)元退行性變中發(fā)揮重要作用。GRK6晶體結(jié)構(gòu)顯示,在氨基端區(qū)的G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)子(RGS)結(jié)構(gòu)域中存在一個(gè)由Ile39、Met165、Tyr166和Phe527 4個(gè)疏水性氨基酸組成的同源二聚化作用界面,人工突變這些氨基酸殘基導(dǎo)致GRK6蛋白的激酶活性顯著降低。因此,二聚化可能是GRK6調(diào)控GPCR的重要機(jī)制之一。迄今為止,還未有GRK在細(xì)胞內(nèi)形成二聚體的報(bào)道。另一方面,定位細(xì)胞膜是GRK調(diào)控GPCR信號(hào)通路的前提條件,而GRK6分子同源二聚化對(duì)其胞膜定位的影響目前還不清楚。本研究旨在揭示GRK6在細(xì)胞內(nèi)同源二聚化的現(xiàn)象與機(jī)制、及其對(duì)GRK6胞膜定位的影響。方法:首先,本實(shí)驗(yàn)采用競(jìng)爭(zhēng)性雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC-C)方法,在共轉(zhuǎn)染融合質(zhì)粒pBiFC-GRK6-VN173/pBiFC-GRK6-VC155基礎(chǔ)上加入GRK6-mCherry及pmCherry-N1至HEK293細(xì)胞中,檢測(cè)BiFC熒光信號(hào)改變。聯(lián)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù),將融合質(zhì)粒GRK6-GFP/GRK6-mCherry與對(duì)照組Gi(1-10)-GFP/GRK6-mCherry分別共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中,在激光共聚焦掃描顯微鏡下以受體光漂白法分析GRK6分子的FRET效率,觀察GRK6的同源二聚化現(xiàn)象。其次,人工突變GRK6的Met165、Tyr166和Phe527三個(gè)氨基酸殘基,構(gòu)建GRK6二聚化界面突變子(GRK6EED)BiFC和FRET質(zhì)粒,檢測(cè)突變體與野生型GRK6的BiFC熒光信號(hào)及FRET效率的改變,評(píng)判其是否為GRK6的同源二聚化界面的關(guān)鍵基團(tuán)。最后,在熒光顯微鏡下觀察突變體與野生型GRK6分子的胞膜定位。結(jié)果:在GRK6-VN173+GRK6-VC155共表達(dá)組檢測(cè)到顯著的BiFC陽(yáng)性信號(hào);其陽(yáng)性信號(hào)的細(xì)胞數(shù)量和BiFC信號(hào)強(qiáng)度可被GRK6-mCherry競(jìng)爭(zhēng)分子顯著抑制。在GRK6-GFP與GRK6-mCherry分子之間檢測(cè)到顯著的FRET信號(hào);轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒組的BiFC信號(hào)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和信號(hào)強(qiáng)度均顯著低于野生型GRK6;突變體的FRET信號(hào)較野生型對(duì)照組顯著降低。最后,Met165、Tyr166和Phe527突變的GRK6分子失去胞膜定位能力,主要分布于胞漿。結(jié)論:研究結(jié)果表明,GRK6在細(xì)胞內(nèi)能夠形成同源二聚體,Met165、Tyr166和Phe527可能是GRK6分子同源二聚化作用界面的關(guān)鍵基團(tuán),并對(duì)GRK6的胞膜定位起重要作用。本研究為證實(shí)GRK6在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源二聚化提供了直接證據(jù),為深入研究GRK6的亞細(xì)胞分布調(diào)控機(jī)制提供了新線索。
【關(guān)鍵詞】：GRK6 同源二聚化 胞膜定位 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 英漢縮略詞對(duì)照表8-10
• 前言10-11
• 1 材料與方法11-30
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器11-19
• 1.2 方法19-30
• 2 結(jié)果30-38
• 3 討論38-41
• 4 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-44
• 附錄（綜述）44-52
• 參考文獻(xiàn)50-52
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄52-53
• 致謝53

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2 張從芬;彭代銀;李慶林;池志強(qiáng);劉景根;;G蛋白偶聯(lián)受體二聚化研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2006年07期

3 蔡欣;陳京;白波;;G蛋白偶聯(lián)受體二聚化在藥物開(kāi)發(fā)中所發(fā)揮的特異性作用(英文)[J];Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences;2011年06期

4 郭曉令;余榕捷;曾智星;李梅;鐘佳萍;張華華;;B族G蛋白偶聯(lián)受體PAC1的N端基序HSDCIF對(duì)其二聚化和上膜運(yùn)輸?shù)挠绊慬J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2013年09期

5 ;[J];;年期

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本文編號(hào)：253381