【摘要】：第一部分：小鼠陰道上皮細胞培養(yǎng)及鑒定 目的：探討小鼠陰道上皮細胞分離、培養(yǎng)和鑒定方法，為構(gòu)建組織工程陰道提供種子細胞。 方法：⑴酶消化法培養(yǎng)：取8周齡雌性昆明小鼠陰道全層，Dispase酶消化后分離上皮層，用胰酶進一步消化成細胞懸液接種到K-SFM培養(yǎng)液中。⑵觀察與鑒定：倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)、貼壁時間、生長特性；MTT法繪制細胞生長曲線；AE1/AE3免疫組化染色鑒定上皮細胞；掃描電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：⑴消化后細胞多為體積較小的圓形透亮細胞，胞漿均勻；接種后24～48h細胞開始貼壁，變成寬大扁平細胞；3～5d細胞增殖顯著，形成克隆群；7～10d細胞連接呈鋪路石狀，融合約80%。⑵使用AE1/AE3對細胞爬片進行免疫組化染色，胞質(zhì)呈棕黃色，表明細胞角蛋白存在，顯微鏡下計數(shù)細胞純度達98%以上。⑶掃描電鏡觀察上皮細胞呈鑲嵌排列，表面可見微絨毛和微褶曲。 結(jié)論：酶消化法原代培養(yǎng)法細胞貼壁快，生長時間短，細胞增殖良好；傳代培養(yǎng)細胞生長良好，能較迅速為組織工程陰道的構(gòu)建提供種子細胞。第二部分：小鼠陰道上皮細胞與豬脫細胞真皮基質(zhì)-纖維蛋白凝膠支架復(fù)合移植物的生物相容性研究 目的：構(gòu)建小鼠陰道上皮細胞與PADM-纖維蛋白凝膠支架復(fù)合移植物，并探討復(fù)合支架材料的生物相容性，驗證此種構(gòu)建方式的可行性。 方法：⑴將纖維蛋白原、凝血酶、抑肽酶、CaCl2溶液以不同順序和濃度混合，觀察纖維蛋白凝膠形成時間、降解時間、凝膠固化后的硬度等，選擇最佳的混合比例。⑵將小鼠陰道上皮細胞接種到纖維蛋白凝膠內(nèi)培養(yǎng)，觀察細胞生長情況。⑶構(gòu)建小鼠陰道上皮細胞與PADM-纖維蛋白凝膠支架復(fù)合移植物，將其埋植到小鼠脊柱兩側(cè)皮下。于移植后2、4、8和12周取材，大體觀察后制成組織切片，行HE染色和VG染色，觀察和評價移植片組織的生長狀況；用AE1/AE3進行免疫組化染色，以證實是否有上皮組織形成。 結(jié)果：⑴小鼠陰道上皮細胞在凝膠中呈三維均勻分布。培養(yǎng)6h可見細胞有多個觸角向三維空間伸出，12h后大部分細胞有多個觸角伸出，生長良好。⑵皮下移植后大體觀察：各取材時間未發(fā)現(xiàn)感染與免疫排斥反應(yīng)。⑶皮下移植后組織觀察：皮下埋植后2周，可見少量陰道上皮細胞；4周形成上皮，，僅2～3層；8～12周上皮層數(shù)增多。VG染色顯示隨埋植時間推移PADM內(nèi)逐漸有細胞長入，結(jié)構(gòu)逐漸降解。AE1/AE3免疫組化染色結(jié)果與HE染色結(jié)果一致，證實有上皮組織形成，但是上皮細胞無極向排列。 結(jié)論：PADM-纖維蛋白凝膠支架具有良好的生物相容性，與小鼠陰道上皮細胞構(gòu)建移植復(fù)合物體內(nèi)移植后有血管長入，形成的上皮組織表型與正常陰道上皮表型相同。第三部分：小鼠陰道上皮細胞和豬脫細胞真皮基質(zhì)體內(nèi)與原位構(gòu)建組織工程陰道的比較研究 目的：觀察原位組織構(gòu)建與體內(nèi)構(gòu)建兩種方式在小鼠體內(nèi)進行陰道構(gòu)建的效果，探討組織工程陰道的構(gòu)建方式。 方法：將昆明小鼠隨機分為Ａ、Ｂ兩組，行陰道全切后進行陰道重建。Ａ組植入PADM行原位陰道組織構(gòu)建；Ｂ組植入小鼠陰道上皮細胞與PADM-纖維蛋白凝膠移植復(fù)合物行體內(nèi)構(gòu)建。于移植后2、4、8、12周取出重建陰道組織進行大體觀察，并分別進行HE染色、VG染色和AE1/AE3免疫組化染色，以動態(tài)觀察重建陰道組織生長情況及PADM降解情況。重建術(shù)后12周B組重建陰道組織用透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：A組重建陰道在移植后2周可見約2～3層上皮層形成；移植后4周細胞層數(shù)增加，但細胞排列無極向；移植后8、12周上皮層結(jié)構(gòu)接近正常小鼠陰道上皮層結(jié)構(gòu)。B組移植后2周上皮結(jié)構(gòu)即接近正常小鼠陰道上皮層結(jié)構(gòu)；移植后4、8、12周上皮層結(jié)構(gòu)同移植后2周。兩組均可見PADM結(jié)構(gòu)隨時間推移逐漸疏松，移植后12周A組PADM部分區(qū)域結(jié)構(gòu)不完整，B組PADM仍保持基本形態(tài)。AE1/AE3免疫組化染色結(jié)果與HE染色結(jié)果一致。Ｂ組透射電鏡觀察可見上皮細胞之間由橋粒連接，上皮細胞與基底膜之間半橋粒連接。上皮層下見成纖維細胞、無髓神經(jīng)纖維與毛細血管。 結(jié)論：利用PADM進行原位組織構(gòu)建與體內(nèi)構(gòu)建在實驗動物體內(nèi)均能夠完成陰道重建。原位組織構(gòu)建方法簡單，但陰道上皮化形成所需時間較長，較易出現(xiàn)陰道狹窄與閉鎖；體內(nèi)構(gòu)建過程相對復(fù)雜，但是上皮化形成所需時間短。利用組織工程技術(shù)為陰道重建術(shù)提供組織里襯具有可行性。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R-332;R713

【參考文獻】

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