【摘要】：本研究由農(nóng)業(yè)部重大專項-抗布病與結核病關鍵功能基因的篩選與驗證資助。 當Mtb這種胞內(nèi)寄生菌侵入宿主細胞后，Mtb通過一些逃逸機制逃避宿主的免疫監(jiān)控作用后可成功寄生于宿主的吞噬細胞內(nèi)。由于機體內(nèi)存在著復雜的免疫反應，培養(yǎng)細胞模型所得的Mtb毒力因子表型研究數(shù)據(jù)比感染動物模型所得相關數(shù)據(jù)更準確。目前，常用細胞模型有RAW264.7與THP-1兩種。本研究主要通過Solexa/Illumina高通量測序技術分析被人結核分枝桿菌(H37Rv)或牛分枝桿菌(BCG)感染3小時后的RAW264.7細胞全基因組轉錄表達譜變化。實驗結果顯示：(1)與BCG相比，RAW264.7中1,917差異表達基因中的1,135個基因被H37Rv感染后上調(diào)表達，782個基因被H37Rv下調(diào)表達；(2)上述1,917個差異表達的基因中，1822個在GenBank有記錄，95個是新基因；(3)GO分析與KO分析顯示，71%差異基因共參與210條代謝或信號通路；(4)與病原體識別受體和結核分枝桿菌和宿主的相互作用有關通路共28條。Real Time-PCR驗證結果與高通量測序結果高度一致。上述發(fā)現(xiàn)的差異表達基因將為進一步研究Mtb作用的宿主細胞蛋白分子奠定基礎。 最新研究發(fā)現(xiàn)轉錄因子FoxO1可誘發(fā)心肌細胞內(nèi)自體吞噬的產(chǎn)生。自體吞噬在增強宿主有效控制和殺滅入侵宿主的Mtb和提高結核疫苗效率方面起重要作用。本研究的前期實驗結果發(fā)現(xiàn)，當細胞受到H37Rv與BCG感染RAW264.7后，RAW264.7中轉錄因子FoxO1表達量顯著性下降。本研究利用pEGFP-N1表達載體與pCMV-tdTomato表達載體成功構建重組載體pCMV-tdTomato-FoxO1，并將其通過脂質體轉染方法轉入RAW264.7中。RealTime-PCR實驗結果表明，被重組載體pCMV-tdTomato-FoxO1轉染12h時，RAW264.7中目的基因FoxO1，F(xiàn)oxO3，LC3，Gabarapl1，Atg12的表達量分別為轉染0h時表達量的3.6倍，1.7倍，2.9倍，2.7倍，5.2倍(p0.05; n=3)。12h后，5個目的基因的表達量均有所降低；24h時，目的基因表達量仍高于其在對照組中的表達量，F(xiàn)oxO12.1倍，F(xiàn)oxO31.5倍，LC31.9倍，Gabarapl11.8倍，Atg123.8倍，(p0.05; n=3)。Western blotting實驗結果表明，RAW264.7被重組載體pCMV-tdTomato-FoxO1轉染前12h，LC3II蛋白水平表達量逐漸提高，LC3I蛋白水平表達量逐漸降低；12h時，LC3II蛋白水平表達量達最高值；12h后，LC3II蛋白水平表達量逐漸降低。MDC染色檢測自體吞噬現(xiàn)象實驗證明，RAW264.7被重組載體pCMV-tdTomato-FoxO1轉染24h后，自噬空泡的積聚顯著增強。激光共聚焦觀察自體吞噬相關蛋白在細胞中的分布實驗證明，F(xiàn)oxO1過表達24h后自體吞噬標志物LAMP-1與GABARAPL1會從細胞質轉移到細胞內(nèi)膜上，，在吞噬體周圍富集；自體吞噬標志物LC3會從細胞質轉移到細胞內(nèi)膜上。 Real Time-PCR實驗結果表明，被重組載體pCMV-tdTomato-FoxO1轉染12h時，RAW264.7中H_2-EAb_1與H2-Eb1的表達量分別為轉染0h時表達量的4.4倍，7.5倍(p0.05;n=3)。12h后，2個目的基因的表達量均有所降低；24h時，目的基因表達量仍高于其0h時的表達量，H2-EAb13.2倍，H_2-Eb_15.4倍(p0.05; n=3)。為探索RAW264.7中FoxO1過表達誘導的自體吞噬現(xiàn)象的發(fā)生對上調(diào)MHC II分子相關基因的表達對RAW264.7抗原呈遞能力的影響，我們接著進行了抗原呈遞實驗�？乖蔬f實驗中使用的抗原為BCG與CFP10，PBS為陰性對照。實驗組的抗原呈遞細胞為FoxO1過表達的RAW264.7，對照組的抗原呈遞細胞為FoxO1正常表達的RAW264.7。抗原呈遞實驗的效應細胞為用BCG、CFP10與PBS三免后的BALB/c小鼠的脾淋巴細胞或外周血單核細胞。為分析FoxO1過表達對MTB抗原的呈遞效率，我們采用MTT法對淋巴細胞增殖做了測定。MTT法檢測體外淋巴細胞增殖水平實驗證實，F(xiàn)oxO1過表達可以促進體外淋巴細胞增殖。同時采用ELISA的方法對實驗組與對照組抗原呈遞后細胞懸液上清中IL-2、IFN-γ與TNF-α這3種細胞因子的濃度進行了測定。ELISA檢測證實，F(xiàn)oxO1過表達可以提高RAW264.7細胞抗原處理和抗原呈遞功能，提高細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的含量。 綜上所述，轉錄因子FoxO1過表達可引發(fā)RAW264.7中自體吞噬現(xiàn)象的發(fā)生，提高RAW264.7表面MHC-II分子相關基因的表達，增強RAW264.7的抗原處理和抗原呈遞效率。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2532095