【摘要】：本研究由農(nóng)業(yè)部重大專項(xiàng)-抗布病與結(jié)核病關(guān)鍵功能基因的篩選與驗(yàn)證資助。 當(dāng)Mtb這種胞內(nèi)寄生菌侵入宿主細(xì)胞后，Mtb通過(guò)一些逃逸機(jī)制逃避宿主的免疫監(jiān)控作用后可成功寄生于宿主的吞噬細(xì)胞內(nèi)。由于機(jī)體內(nèi)存在著復(fù)雜的免疫反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞模型所得的Mtb毒力因子表型研究數(shù)據(jù)比感染動(dòng)物模型所得相關(guān)數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。目前，常用細(xì)胞模型有RAW264.7與THP-1兩種。本研究主要通過(guò)Solexa/Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析被人結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)或牛分枝桿菌(BCG)感染3小時(shí)后的RAW264.7細(xì)胞全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)與BCG相比，RAW264.7中1,917差異表達(dá)基因中的1,135個(gè)基因被H37Rv感染后上調(diào)表達(dá)，782個(gè)基因被H37Rv下調(diào)表達(dá)；(2)上述1,917個(gè)差異表達(dá)的基因中，1822個(gè)在GenBank有記錄，95個(gè)是新基因；(3)GO分析與KO分析顯示，71%差異基因共參與210條代謝或信號(hào)通路；(4)與病原體識(shí)別受體和結(jié)核分枝桿菌和宿主的相互作用有關(guān)通路共28條。Real Time-PCR驗(yàn)證結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果高度一致。上述發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因?qū)檫M(jìn)一步研究Mtb作用的宿主細(xì)胞蛋白分子奠定基礎(chǔ)。 最新研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FoxO1可誘發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)自體吞噬的產(chǎn)生。自體吞噬在增強(qiáng)宿主有效控制和殺滅入侵宿主的Mtb和提高結(jié)核疫苗效率方面起重要作用。本研究的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到H37Rv與BCG感染RAW264.7后，RAW264.7中轉(zhuǎn)錄因子FoxO1表達(dá)量顯著性下降。本研究利用pEGFP-N1表達(dá)載體與pCMV-tdTomato表達(dá)載體成功構(gòu)建重組載體pCMV-tdTomato-FoxO1，并將其通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)入RAW264.7中。RealTime-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，被重組載體pCMV-tdTomato-FoxO1轉(zhuǎn)染12h時(shí)，RAW264.7中目的基因FoxO1，F(xiàn)oxO3，LC3，Gabarapl1，Atg12的表達(dá)量分別為轉(zhuǎn)染0h時(shí)表達(dá)量的3.6倍，1.7倍，2.9倍，2.7倍，5.2倍(p0.05; n=3)。12h后，5個(gè)目的基因的表達(dá)量均有所降低；24h時(shí)，目的基因表達(dá)量仍高于其在對(duì)照組中的表達(dá)量，F(xiàn)oxO12.1倍，F(xiàn)oxO31.5倍，LC31.9倍，Gabarapl11.8倍，Atg123.8倍，(p0.05; n=3)。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RAW264.7被重組載體pCMV-tdTomato-FoxO1轉(zhuǎn)染前12h，LC3II蛋白水平表達(dá)量逐漸提高，LC3I蛋白水平表達(dá)量逐漸降低；12h時(shí)，LC3II蛋白水平表達(dá)量達(dá)最高值；12h后，LC3II蛋白水平表達(dá)量逐漸降低。MDC染色檢測(cè)自體吞噬現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)證明，RAW264.7被重組載體pCMV-tdTomato-FoxO1轉(zhuǎn)染24h后，自噬空泡的積聚顯著增強(qiáng)。激光共聚焦觀察自體吞噬相關(guān)蛋白在細(xì)胞中的分布實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)oxO1過(guò)表達(dá)24h后自體吞噬標(biāo)志物L(fēng)AMP-1與GABARAPL1會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)膜上，，在吞噬體周圍富集；自體吞噬標(biāo)志物L(fēng)C3會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)膜上。 Real Time-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，被重組載體pCMV-tdTomato-FoxO1轉(zhuǎn)染12h時(shí)，RAW264.7中H_2-EAb_1與H2-Eb1的表達(dá)量分別為轉(zhuǎn)染0h時(shí)表達(dá)量的4.4倍，7.5倍(p0.05;n=3)。12h后，2個(gè)目的基因的表達(dá)量均有所降低；24h時(shí)，目的基因表達(dá)量仍高于其0h時(shí)的表達(dá)量，H2-EAb13.2倍，H_2-Eb_15.4倍(p0.05; n=3)。為探索RAW264.7中FoxO1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的自體吞噬現(xiàn)象的發(fā)生對(duì)上調(diào)MHC II分子相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)RAW264.7抗原呈遞能力的影響，我們接著進(jìn)行了抗原呈遞實(shí)驗(yàn)。抗原呈遞實(shí)驗(yàn)中使用的抗原為BCG與CFP10，PBS為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組的抗原呈遞細(xì)胞為FoxO1過(guò)表達(dá)的RAW264.7，對(duì)照組的抗原呈遞細(xì)胞為FoxO1正常表達(dá)的RAW264.7�？乖蔬f實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)細(xì)胞為用BCG、CFP10與PBS三免后的BALB/c小鼠的脾淋巴細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞。為分析FoxO1過(guò)表達(dá)對(duì)MTB抗原的呈遞效率，我們采用MTT法對(duì)淋巴細(xì)胞增殖做了測(cè)定。MTT法檢測(cè)體外淋巴細(xì)胞增殖水平實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)oxO1過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)體外淋巴細(xì)胞增殖。同時(shí)采用ELISA的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組抗原呈遞后細(xì)胞懸液上清中IL-2、IFN-γ與TNF-α這3種細(xì)胞因子的濃度進(jìn)行了測(cè)定。ELISA檢測(cè)證實(shí)，F(xiàn)oxO1過(guò)表達(dá)可以提高RAW264.7細(xì)胞抗原處理和抗原呈遞功能，提高細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的含量。 綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子FoxO1過(guò)表達(dá)可引發(fā)RAW264.7中自體吞噬現(xiàn)象的發(fā)生，提高RAW264.7表面MHC-II分子相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)RAW264.7的抗原處理和抗原呈遞效率。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2532095