【摘要】：結(jié)核病疫情在世界范圍內(nèi)的急劇惡化已引起全球廣泛關(guān)注。全球近1/3的人口感染過(guò)結(jié)核菌。更嚴(yán)重的是對(duì)一線(xiàn)藥物(異煙肼(Isoniazidum)、利福平(Rifampin)、鏈霉素(Sstreptomycin)和乙胺丁醇(Eethambatal))甚至二線(xiàn)藥物(乙硫異煙胺(Ethionamide)/丙硫異煙胺(Protionamide)、環(huán)絲氨酸(Cycloserine)、對(duì)氨基水楊酸(P-aminosalicylic acid))的耐受的菌株層出不窮。致使人類(lèi)的健康水平受到嚴(yán)重的威脅。因此,尋找更有效的藥物來(lái)治療這個(gè)頑固性疾病是擺在醫(yī)藥工作者面前的重要課題。 輔因子的生物合成途徑是一個(gè)豐富的潛在藥物靶標(biāo)資源庫(kù)。其中NAD是生物體中廣泛存在且必須的輔因子。NAD參與許多氧化還原反應(yīng),能量代謝,活細(xì)胞代謝調(diào)節(jié),蛋白翻譯后的修飾,細(xì)胞凋亡,DNA修復(fù),端粒的保護(hù),基因沉默,細(xì)胞壽命,內(nèi)分泌調(diào)節(jié),免疫應(yīng)答和鈣離子信號(hào)通路,NAD還是VB12的合成的前體物等重要的生物過(guò)程。我們利用基因組對(duì)比分析和子系統(tǒng)注釋工具,憑借SEED基因操作平臺(tái)(http://theseed.uchicago.edu/FIG/index.cgi),重新構(gòu)建了NAD在生物界中的合成途徑。到目前為止主要有六條途徑,分別是De novo pathway (Try), NmR pathway (NRK-依賴(lài)型),NmR pathway (NRK-非依賴(lài)型),Niacin recycling。 因此,研究NAD生物合成代謝的關(guān)鍵且保守的酶,并作為開(kāi)發(fā)研制新型的抗結(jié)核病的藥物靶標(biāo)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。其中Mycobacterium tuberculosis擁有的是De novo pathway(Asp)和Niacin salavage兩條途徑,而NaNMAT, NADS, NADK是存在于M.tuberculosis兩條NAD生物合成途徑中的三個(gè)關(guān)鍵酶,因此是備受關(guān)注的潛在藥物靶標(biāo)。本研究主要是對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的NaNMAT基因nadD (Rv2421c)的克隆、表達(dá)及活性研究,并利用生物信息學(xué)對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析及預(yù)測(cè)。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得結(jié)核分枝桿菌H37Rv的NaNMAT基因nadD的核苷酸序列,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,以結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組為模板,體外擴(kuò)增獲得nadD基因。通過(guò)TA克隆,將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector,然后亞克隆至載體pET28a(+)中,經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切以及序列測(cè)定證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28-nadD。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)對(duì)該重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá),Ni+凝膠親和層析方法純化獲得高純度的重組NaNMAT。我們還將克隆出來(lái)的Rv21c通過(guò)構(gòu)建大腸桿菌和恥垢分枝桿菌之間的穿梭質(zhì)粒pMV261的重組質(zhì)粒,來(lái)研究過(guò)表達(dá)該酶對(duì)宿主菌的影響,重組NaNMAT恥垢分支桿菌的宿主菌對(duì)氧化壓力,紫外線(xiàn)照射,酸,堿,SDS, CuSO4等外界壓力條件的耐受性均增強(qiáng)。我們?cè)隗w外利用胰島素的凝集實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)NaNMAT具有分子伴侶的功能,從而解釋了其對(duì)外界壓力的抵抗的基本機(jī)理。證明NaNMAT作為分子伴侶對(duì)細(xì)菌生存的影響。 我們還利用生物信息學(xué)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的NaNMAT進(jìn)行預(yù)測(cè)研究,結(jié)果揭示了NaNMAT是pI為5.16,沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)的定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白,而且其在進(jìn)化中是與人類(lèi)和果蠅NNMAT的距離較遠(yuǎn)的蛋白,氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析也說(shuō)明了他們的差別很大。
【圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文綜述類(lèi)與蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象相結(jié)合并使之穩(wěn)定。它在蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程中主要起2個(gè)作用:(l)幫助變性蛋白質(zhì)完成正確的折疊;(2)在ATP的存在下負(fù)責(zé)對(duì)正在復(fù)性或復(fù)性好的蛋白質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控，防止蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊l30]。1.3NaMNAT的基本概述1.3.1NMN加aMNAT催化的反應(yīng)和其結(jié)構(gòu)特征此酶可催化NaMN(NMN)形成NaAD(NAD)(如圖2)，根據(jù)此酶對(duì)底物的偏好性不同，可以將其分為兩類(lèi)(1.)NaMNAT(EC:2.7.718):表現(xiàn)出對(duì)NaMN而不是咖N作為底物的強(qiáng)烈偏好型，主要存在于真細(xì)菌，(2.)NMNAT(EC:2.7.1.1):表現(xiàn)出NMN/NaMNAT兩方面催化活性，而不是顯著區(qū)分NMN和NaMN作為底物，主要存在于真核生物和古細(xì)菌的(如圖2)。

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)果與討論第四章結(jié)果與討論4.1結(jié)核分枝桿菌H37RvNaMNAT的理化性質(zhì)利用ProtParam分析NaMNAT(EC=2.7.7.18)基因顯示該蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為23.053動(dòng)a，理論等電點(diǎn)(pl)為5.16，推測(cè)分子式為Clo23H15s5N2810川58;不穩(wěn)定系數(shù)(instabilityindex，11)為36.79，表明此蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。使用protscale(http://www.expasy.or彌91一bin/protseale.pl)進(jìn)行疏水性分析，該軟件采用的是Hphob了Kyte&Doolittle算法。平均疏水性分析顯示約有4個(gè)峰值，分布于氨基酸殘基20一35，，50一60，100一110，130一170區(qū)域(見(jiàn)圖8)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R378

【共引文獻(xiàn)】

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1 呂小群;張偌瑜;徐學(xué)文;管云楓;繆朝玉;;煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)、純化及活性測(cè)定[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年11期

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1 呂小群;Nampt/Visfatin酶活性篩選模型的建立[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2529928