【摘要】：結(jié)核病疫情在世界范圍內(nèi)的急劇惡化已引起全球廣泛關(guān)注。全球近1/3的人口感染過結(jié)核菌。更嚴重的是對一線藥物(異煙肼(Isoniazidum)、利福平(Rifampin)、鏈霉素(Sstreptomycin)和乙胺丁醇(Eethambatal))甚至二線藥物(乙硫異煙胺(Ethionamide)/丙硫異煙胺(Protionamide)、環(huán)絲氨酸(Cycloserine)、對氨基水楊酸(P-aminosalicylic acid))的耐受的菌株層出不窮。致使人類的健康水平受到嚴重的威脅。因此,尋找更有效的藥物來治療這個頑固性疾病是擺在醫(yī)藥工作者面前的重要課題。 輔因子的生物合成途徑是一個豐富的潛在藥物靶標資源庫。其中NAD是生物體中廣泛存在且必須的輔因子。NAD參與許多氧化還原反應,能量代謝,活細胞代謝調(diào)節(jié),蛋白翻譯后的修飾,細胞凋亡,DNA修復,端粒的保護,基因沉默,細胞壽命,內(nèi)分泌調(diào)節(jié),免疫應答和鈣離子信號通路,NAD還是VB12的合成的前體物等重要的生物過程。我們利用基因組對比分析和子系統(tǒng)注釋工具,憑借SEED基因操作平臺(http://theseed.uchicago.edu/FIG/index.cgi),重新構(gòu)建了NAD在生物界中的合成途徑。到目前為止主要有六條途徑,分別是De novo pathway (Try), NmR pathway (NRK-依賴型),NmR pathway (NRK-非依賴型),Niacin recycling。 因此,研究NAD生物合成代謝的關(guān)鍵且保守的酶,并作為開發(fā)研制新型的抗結(jié)核病的藥物靶標具有十分重要的現(xiàn)實意義。其中Mycobacterium tuberculosis擁有的是De novo pathway(Asp)和Niacin salavage兩條途徑,而NaNMAT, NADS, NADK是存在于M.tuberculosis兩條NAD生物合成途徑中的三個關(guān)鍵酶,因此是備受關(guān)注的潛在藥物靶標。本研究主要是對結(jié)核分枝桿菌H37Rv的NaNMAT基因nadD (Rv2421c)的克隆、表達及活性研究,并利用生物信息學對該基因編碼蛋白進行結(jié)構(gòu)和功能的分析及預測。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得結(jié)核分枝桿菌H37Rv的NaNMAT基因nadD的核苷酸序列,設計一對引物,以結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組為模板,體外擴增獲得nadD基因。通過TA克隆,將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector,然后亞克隆至載體pET28a(+)中,經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切以及序列測定證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28-nadD。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)對該重組蛋白質(zhì)誘導表達,Ni+凝膠親和層析方法純化獲得高純度的重組NaNMAT。我們還將克隆出來的Rv21c通過構(gòu)建大腸桿菌和恥垢分枝桿菌之間的穿梭質(zhì)粒pMV261的重組質(zhì)粒,來研究過表達該酶對宿主菌的影響,重組NaNMAT恥垢分支桿菌的宿主菌對氧化壓力,紫外線照射,酸,堿,SDS, CuSO4等外界壓力條件的耐受性均增強。我們在體外利用胰島素的凝集實驗來證實NaNMAT具有分子伴侶的功能,從而解釋了其對外界壓力的抵抗的基本機理。證明NaNMAT作為分子伴侶對細菌生存的影響。 我們還利用生物信息學對結(jié)核分枝桿菌的NaNMAT進行預測研究,結(jié)果揭示了NaNMAT是pI為5.16,沒有跨膜結(jié)構(gòu)的定位在細胞質(zhì)內(nèi)蛋白,而且其在進化中是與人類和果蠅NNMAT的距離較遠的蛋白,氨基酸的一級結(jié)構(gòu)分析也說明了他們的差別很大。
【圖文】：

西南大學碩士學位論文綜述類與蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象相結(jié)合并使之穩(wěn)定。它在蛋白質(zhì)復性過程中主要起2個作用:(l)幫助變性蛋白質(zhì)完成正確的折疊;(2)在ATP的存在下負責對正在復性或復性好的蛋白質(zhì)進行監(jiān)控，防止蛋白質(zhì)錯誤折疊l30]。1.3NaMNAT的基本概述1.3.1NMN加aMNAT催化的反應和其結(jié)構(gòu)特征此酶可催化NaMN(NMN)形成NaAD(NAD)(如圖2)，根據(jù)此酶對底物的偏好性不同，可以將其分為兩類(1.)NaMNAT(EC:2.7.718):表現(xiàn)出對NaMN而不是咖N作為底物的強烈偏好型，主要存在于真細菌，(2.)NMNAT(EC:2.7.1.1):表現(xiàn)出NMN/NaMNAT兩方面催化活性，而不是顯著區(qū)分NMN和NaMN作為底物，主要存在于真核生物和古細菌的(如圖2)。

西南大學碩士學位論文結(jié)果與討論第四章結(jié)果與討論4.1結(jié)核分枝桿菌H37RvNaMNAT的理化性質(zhì)利用ProtParam分析NaMNAT(EC=2.7.7.18)基因顯示該蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為23.053動a，理論等電點(pl)為5.16，推測分子式為Clo23H15s5N2810川58;不穩(wěn)定系數(shù)(instabilityindex，11)為36.79，表明此蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。使用protscale(http://www.expasy.or彌91一bin/protseale.pl)進行疏水性分析，該軟件采用的是Hphob了Kyte&Doolittle算法。平均疏水性分析顯示約有4個峰值，分布于氨基酸殘基20一35，，50一60，100一110，130一170區(qū)域(見圖8)。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【共引文獻】

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1 呂小群;張偌瑜;徐學文;管云楓;繆朝玉;;煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的表達、純化及活性測定[J];第二軍醫(yī)大學學報;2010年11期

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1 呂小群;Nampt/Visfatin酶活性篩選模型的建立[D];第二軍醫(yī)大學;2010年

本文編號：2529928