【摘要】：研究背景：B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白31（BAP31）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上不可缺少的跨膜蛋白，分子量28KD。BAP31進(jìn)化保守，廣泛表達(dá)于各個(gè)組織。研究表明BAP31能夠促進(jìn)MHC-I、小細(xì)胞小泡蛋白（cellubrevin）、四跨膜家族蛋白（tetraspanins）以及囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosistransmembrane conductance regulator CFTR）等分子離開(kāi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）以囊泡的形式向其他細(xì)胞器的運(yùn)輸；在中性粒細(xì)胞中，BAP31促進(jìn)CD11b/CD18分子從次級(jí)顆粒向包膜的運(yùn)輸。此外，BAP31還與mIgD、細(xì)胞色素P4502C2、PTPLB在ER的駐留有關(guān)。BAP31的另一功能為凋亡相關(guān)，其胞漿區(qū)含有兩個(gè)相同的caspase識(shí)別位點(diǎn)（AAVD.G），多數(shù)caspase8活化后通過(guò)BAP31剪切產(chǎn)物p20發(fā)揮作用。如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERstress）、鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin CRT）外翻過(guò)程中都有BAP31的參與。此外，BAP31通過(guò)從ER向線粒體傳遞鈣離子信號(hào)，使凋亡反應(yīng)在兩個(gè)細(xì)胞器間形成環(huán)路。我們前期的研究顯示：BAP31在不同組織中的表達(dá)水平并不相同，在人正常組織中不表達(dá)或很低表達(dá)（除睪丸組織外），但在多種腫瘤組織中高水平表達(dá)，其中以宮頸癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性率最高。隨后，我們以人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞為模型研究其生物學(xué)行為進(jìn)一步證實(shí)，干涉BAP31的表達(dá)后Hela細(xì)胞增殖速度減慢，出現(xiàn)G1期阻滯且侵襲能力明顯降低，對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡敏感性增加。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示：BAP31是一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原，并可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。 ETS家族因與禽類(lèi)白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒E26中的原癌基因v-ets同源而得名。ETS家族成員都有一個(gè)特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域--ETS結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含大約80個(gè)氨基酸，其中有4個(gè)色氨酸重復(fù)序列。ETS依靠其GGAA/T核心序列及不同的側(cè)翼序列與DNA結(jié)合，，既可介導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄活化，也可介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制。核心序列旁的側(cè)翼序列以及與ETS結(jié)合的共轉(zhuǎn)錄因子決定DNA結(jié)合的特異性。多種轉(zhuǎn)錄因子、內(nèi)部調(diào)控序列的磷酸化、乙�；约癝UMO（小泛素相關(guān)修飾物）的修飾等都可調(diào)節(jié)ETS的轉(zhuǎn)錄激活或抑制功能。與ETS相互作用的轉(zhuǎn)錄因子包括AP-1，SP-1，NF-κB，CREBP結(jié)合蛋白/p300，Pax以及ETS家族的其他蛋白。ETS-1可在不同的細(xì)胞類(lèi)型中發(fā)揮多種作用，如調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、基質(zhì)降解等。 目的：研究BAP31的表達(dá)調(diào)控 方法結(jié)果：從Hela細(xì)胞中提取人基因組DNA，根據(jù)網(wǎng)站預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，通過(guò)PCR方法獲得BAP31轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5k至下游1.5k的調(diào)控序列。構(gòu)建一系列調(diào)控區(qū)的報(bào)告基因載體，并將這些報(bào)告基因轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，48小時(shí)后分析熒光活性，確定啟動(dòng)子范圍。結(jié)果顯示最強(qiáng)的熒光活性位于-122bp~128bp，即BAP31的啟動(dòng)子；此外，-4012bp~-2996bp處還存在一啟動(dòng)子區(qū)或增強(qiáng)子區(qū)，9bp~52bp間可能存在一段負(fù)調(diào)控序列，抑制BAP31啟動(dòng)子的活性。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)BAP31啟動(dòng)子區(qū)含有多處ETS-1結(jié)合位點(diǎn)。將含有BAP31啟動(dòng)子的報(bào)告基因和不同轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，熒光素酶活性顯示ETS-1表達(dá)載體可提高BAP31的啟動(dòng)活性。在Hela細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ETS-1可同時(shí)上調(diào)BAP31的mRNA和蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照載體相比，mRNA水平提高近1倍，蛋白水平提高1.8倍。干擾ETS-1表達(dá)后，BAP31在Hela細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平與無(wú)關(guān)SiRNA相比下降48.6%。生物信息學(xué)分析顯示，BAP31第一外顯子有CpG島存在，miR-137與BAP31的3’非翻譯區(qū)互補(bǔ)，可能參與調(diào)控BAP31的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。 結(jié)論：ETS-1參與BAP31的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R392.1

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本文編號(hào)：2527115