發(fā)布時間：2019-08-15 07:38

【摘要】：乙型肝炎病毒目前依然是影響廣大發(fā)展中國家人民健康的重要病原體。據(jù)統(tǒng)計,全球仍然有3億5千萬人感染乙型肝炎病毒,其中我國攜帶乙型肝炎病毒人數(shù)約占23%。盡管大規(guī)模的計劃內(nèi)疫苗接種已經(jīng)大大降低了新生兒感染乙型肝炎病毒的風險,但是對已經(jīng)感染乙型肝炎病毒的廣大人群目前依然缺乏十分有效的藥物以清除病毒。目前臨床上使用干擾素a可以有效抑制乙型肝炎病毒復制,但是僅對不到30%的患者有效。遺憾的是,造成大部分乙型肝炎患者干擾素抵抗的分子機制至今仍不是十分清楚。 I型干擾素(包括干擾素α[與干擾素β)是天然免疫的重要有機組成部分,在對抗并清除病毒性感染中發(fā)揮不可替代的作用。研究表明I型干擾素的誘生依賴于宿主細胞模式識別受體識別相關(guān)病毒成分并啟動相關(guān)信號通路。然而,長期的生存壓力促使以寄生為唯一生存方式的病毒進化出相應的對抗機制以克服I型干擾素的誘生從而建立并維持長期感染狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者體內(nèi)pDC細胞合成干擾素α能力明顯減弱。已有研究報道肝細胞在病毒或有關(guān)分子刺激下可產(chǎn)生I型干擾素,但乙肝病毒感染肝細胞后可在細胞內(nèi)建立持續(xù)復制,提示病毒也能拮抗肝細胞干擾素的誘生或作用。而且有報道的確證實HBsAg、HBeAg以及病毒顆�？梢砸种芓oll樣受體介導的I型干擾素以及炎性因子的誘生。但是對于乙型肝炎病毒對肝細胞內(nèi)RIG-I介導I型干擾素誘生途徑是否存在抑制作用及機制目前了解不多。 為此,本研究通過雙熒光報告體系篩查定位于胞漿的病毒蛋白成分(Core蛋白,X蛋白以及Pol蛋白)對干擾素β啟動子活性的影響,發(fā)現(xiàn)Pol蛋白對干擾素p啟動子存在抑制現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上,通過實時定量PCR技術(shù)以及ELISA技術(shù)檢測了Pol蛋白對內(nèi)源性干擾素p誘生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pol可以劑量依賴形式抑制內(nèi)源性干擾素p的誘生。同時,病毒攻擊保護實驗證實Pol蛋白可以通過抑制PH5CH8誘生干擾素p從而消弱其保護Vero細胞抵抗NDV-GFP的感染能力。上述研究結(jié)果確認了乙型肝炎病毒Pol蛋白對原代肝細胞系PH5CH8干擾素β誘生的抑制效應。 為了揭示Pol蛋白抑制干擾素β誘生的分子機制,將Pol與I型干擾素誘生通路中一系列關(guān)鍵分子共轉(zhuǎn)染293T細胞,通過監(jiān)測干擾素β的啟動子活性變化來鎖定Pol蛋白抑制I型干擾素誘生的環(huán)節(jié)。結(jié)果顯示Pol可以抑制蛋白激酶TBK1/IKKε及其上游所有關(guān)鍵分子對干擾素β啟動子的活化能力,但對干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)永久活化突變體沒有抑制效應。為此,將Pol抑制I型干擾素誘生的環(huán)節(jié)鎖定在TBK1/IKKε水平。進一步檢測發(fā)現(xiàn)Pol蛋白可以抑制內(nèi)源性IRF3活化,但是并未檢測到Pol與IRF3存在直接相互作用,由此推測Pol可能通過某種間接途徑抑制內(nèi)源性IRF3的活化。 由于有文獻報道DDX3與TBK1/IKKε存在相互作用并參與TBK1/IKKε誘生I型干擾素,而且DDX3亦可以結(jié)合Pol抑制乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄,故通過免疫共沉淀技術(shù)比較Pol表達對DDX3與TBK1/IKKε相互作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pol表達可以抑制DDX3與TBK1/IKKε相互作用,同時還可以降低TBK1/IKKε對DDX3磷酸化效應。而過表達DDX3可以恢復Pol對I型干擾素的抑制能力,這提示Pol可能通過競爭性結(jié)合DDX3、降低TBK1/IKKε與DDX3相互作用機會從而發(fā)揮抑制I型干擾素誘生能力。 本研究首次揭示了乙型肝炎病毒多聚酶Pol參與病毒對I型干擾素誘生的抑制作用,鎖定其抑制環(huán)節(jié)發(fā)生在TBK1/IKKε水平,并且證實DDX3可能是Pol抑制I型干擾素誘生的靶點。上述結(jié)果有助于推動乙型肝炎病毒感染慢性化機制的研究以及新的靶點藥物開發(fā)。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R373

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本文編號：2526853