【摘要】：乙型肝炎病毒目前依然是影響廣大發(fā)展中國(guó)家人民健康的重要病原體。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球仍然有3億5千萬(wàn)人感染乙型肝炎病毒,其中我國(guó)攜帶乙型肝炎病毒人數(shù)約占23%。盡管大規(guī)模的計(jì)劃內(nèi)疫苗接種已經(jīng)大大降低了新生兒感染乙型肝炎病毒的風(fēng)險(xiǎn),但是對(duì)已經(jīng)感染乙型肝炎病毒的廣大人群目前依然缺乏十分有效的藥物以清除病毒。目前臨床上使用干擾素a可以有效抑制乙型肝炎病毒復(fù)制,但是僅對(duì)不到30%的患者有效。遺憾的是,造成大部分乙型肝炎患者干擾素抵抗的分子機(jī)制至今仍不是十分清楚。 I型干擾素(包括干擾素α[與干擾素β)是天然免疫的重要有機(jī)組成部分,在對(duì)抗并清除病毒性感染中發(fā)揮不可替代的作用。研究表明I型干擾素的誘生依賴(lài)于宿主細(xì)胞模式識(shí)別受體識(shí)別相關(guān)病毒成分并啟動(dòng)相關(guān)信號(hào)通路。然而,長(zhǎng)期的生存壓力促使以寄生為唯一生存方式的病毒進(jìn)化出相應(yīng)的對(duì)抗機(jī)制以克服I型干擾素的誘生從而建立并維持長(zhǎng)期感染狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者體內(nèi)pDC細(xì)胞合成干擾素α能力明顯減弱。已有研究報(bào)道肝細(xì)胞在病毒或有關(guān)分子刺激下可產(chǎn)生I型干擾素,但乙肝病毒感染肝細(xì)胞后可在細(xì)胞內(nèi)建立持續(xù)復(fù)制,提示病毒也能拮抗肝細(xì)胞干擾素的誘生或作用。而且有報(bào)道的確證實(shí)HBsAg、HBeAg以及病毒顆粒可以抑制Toll樣受體介導(dǎo)的I型干擾素以及炎性因子的誘生。但是對(duì)于乙型肝炎病毒對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)RIG-I介導(dǎo)I型干擾素誘生途徑是否存在抑制作用及機(jī)制目前了解不多。 為此,本研究通過(guò)雙熒光報(bào)告體系篩查定位于胞漿的病毒蛋白成分(Core蛋白,X蛋白以及Pol蛋白)對(duì)干擾素β啟動(dòng)子活性的影響,發(fā)現(xiàn)Pol蛋白對(duì)干擾素p啟動(dòng)子存在抑制現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)以及ELISA技術(shù)檢測(cè)了Pol蛋白對(duì)內(nèi)源性干擾素p誘生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pol可以劑量依賴(lài)形式抑制內(nèi)源性干擾素p的誘生。同時(shí),病毒攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Pol蛋白可以通過(guò)抑制PH5CH8誘生干擾素p從而消弱其保護(hù)Vero細(xì)胞抵抗NDV-GFP的感染能力。上述研究結(jié)果確認(rèn)了乙型肝炎病毒Pol蛋白對(duì)原代肝細(xì)胞系PH5CH8干擾素β誘生的抑制效應(yīng)。 為了揭示Pol蛋白抑制干擾素β誘生的分子機(jī)制,將Pol與I型干擾素誘生通路中一系列關(guān)鍵分子共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過(guò)監(jiān)測(cè)干擾素β的啟動(dòng)子活性變化來(lái)鎖定Pol蛋白抑制I型干擾素誘生的環(huán)節(jié)。結(jié)果顯示Pol可以抑制蛋白激酶TBK1/IKKε及其上游所有關(guān)鍵分子對(duì)干擾素β啟動(dòng)子的活化能力,但對(duì)干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)永久活化突變體沒(méi)有抑制效應(yīng)。為此,將Pol抑制I型干擾素誘生的環(huán)節(jié)鎖定在TBK1/IKKε水平。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Pol蛋白可以抑制內(nèi)源性IRF3活化,但是并未檢測(cè)到Pol與IRF3存在直接相互作用,由此推測(cè)Pol可能通過(guò)某種間接途徑抑制內(nèi)源性IRF3的活化。 由于有文獻(xiàn)報(bào)道DDX3與TBK1/IKKε存在相互作用并參與TBK1/IKKε誘生I型干擾素,而且DDX3亦可以結(jié)合Pol抑制乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄,故通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)比較Pol表達(dá)對(duì)DDX3與TBK1/IKKε相互作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pol表達(dá)可以抑制DDX3與TBK1/IKKε相互作用,同時(shí)還可以降低TBK1/IKKε對(duì)DDX3磷酸化效應(yīng)。而過(guò)表達(dá)DDX3可以恢復(fù)Pol對(duì)I型干擾素的抑制能力,這提示Pol可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DDX3、降低TBK1/IKKε與DDX3相互作用機(jī)會(huì)從而發(fā)揮抑制I型干擾素誘生能力。 本研究首次揭示了乙型肝炎病毒多聚酶Pol參與病毒對(duì)I型干擾素誘生的抑制作用,鎖定其抑制環(huán)節(jié)發(fā)生在TBK1/IKKε水平,并且證實(shí)DDX3可能是Pol抑制I型干擾素誘生的靶點(diǎn)。上述結(jié)果有助于推動(dòng)乙型肝炎病毒感染慢性化機(jī)制的研究以及新的靶點(diǎn)藥物開(kāi)發(fā)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R373

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