【摘要】：γδT細(xì)胞是脊椎動(dòng)物體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的一個(gè)重要亞群,它在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等方面均具有重要作用。Vγ9Vδ2 T細(xì)胞是人外周血中γδT細(xì)胞的主要亞群,可以通過T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別病原微生物的非肽類抗原和類似于自然殺傷的兩種方式發(fā)揮抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建Vγ9Vδ2 T細(xì)胞受體的融合片段,并通過在原核系統(tǒng)中大量表達(dá)Vγ9Vδ2蛋白為進(jìn)一步研究γδTCR的晶體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供有力工具。 目的: 將Vγ9和Vδ2片段融合,探討Vγ9Vδ2融合片段在不同載體中的表達(dá)情況,找到適合Vγ9Vδ2大量可溶表達(dá)的條件,從而為闡明Vγ9Vδ2 T細(xì)胞受體與抗原相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)提供條件,為探索γδT細(xì)胞新的配體提供有效工具,為臨床更好地應(yīng)用γδT細(xì)胞抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能提供理論基礎(chǔ)和研究方向。 方法: 1.Vγ9Vδ2 T細(xì)胞受體基因全長的獲取。從志愿者肘靜脈抽取外周血,加入抗凝劑和PBS,與Ficoll分離液一起,通過梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞。提取總RNA后,利用RT-PCR法分別擴(kuò)增Vγ9Vδ2 T細(xì)胞受體的γ鏈和δ鏈基因全長。 2.Vγ9和Vδ2融合片段的構(gòu)建。用含有連接子序列的特異性引物分別擴(kuò)增Vγ9和Vδ2片段,通過overlap PCR將兩者融合。 3.篩選適合Vγ9Vδ2融合片段表達(dá)的原核載體。將Vγ9Vδ2融合片段分別連接到pGEX-6p-1、pET28a、pET32a和pET43.1a,小量表達(dá)后檢測(cè)Vγ9Vδ2的各個(gè)表達(dá)情況。 4.Vγ9Vδ2-pET43.1a的大量表達(dá)和純化。將小量表達(dá)情況較好的含有Vγ9Vδ2-pET43.1a質(zhì)粒的大腸桿菌大量培養(yǎng),裂解后通過Ni-NTA純化Vγ9Vδ2的融合蛋白。 結(jié)果: 1.正確的Vγ9Vδ2 T細(xì)胞受體γ鏈和δ鏈序列全長。γδT細(xì)胞在人類外周血中占有的比例非常少,僅占總T淋巴細(xì)胞的5%左右。由于豐度較小,研究者大多先用誘導(dǎo)物刺激外周T淋巴細(xì)胞通過γδT細(xì)胞的擴(kuò)增得到細(xì)胞株,然后提取RNA通過反轉(zhuǎn)錄PCR得到目的基因。而我們通過從外周血分離單個(gè)核細(xì)胞后直接提取RNA,經(jīng)RT-PCR和膠回收后將目的片段連接到測(cè)序載體pEASY-T3上,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,正是Vγ9Vδ2 T細(xì)胞受體序列全長。 2.Vγ9和Vδ2片段融合。γδT細(xì)胞受體是γ和δ兩條鏈組成的異源二聚體。雖然兩條鏈由V區(qū)、(D區(qū),δ鏈)、J區(qū)和C區(qū)組成,但它們識(shí)別抗原和與抗原結(jié)合的部位均在V區(qū)。本實(shí)驗(yàn)中我們首先通過特異性引物擴(kuò)增Vγ9Vδ2 T細(xì)胞受體的γ鏈V區(qū)片段Vγ9和δ鏈V區(qū)片段Vδ2,然后用連接子(Gly4Ser)4連接起來,使兩者融合表達(dá),這樣既便于表達(dá),又利于研究Vγ9Vδ2 T細(xì)胞受體的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能。 3.表達(dá)載體的優(yōu)化。作為一種膜蛋白,Vγ9Vδ2 T細(xì)胞受體的表達(dá)情況一直是限制研究其結(jié)構(gòu)和功能的一個(gè)瓶頸。它在很多載體和菌株中均不表達(dá),或者以包涵體的形式表達(dá)。而研究其功能最需要的是要使之在上清中表達(dá)。我們依據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn),對(duì)比不同的載體發(fā)現(xiàn),與經(jīng)典的pGEX-6p-1、pET28a和pET32a相比,Vγ9Vδ2在pET43.1a載體上表達(dá)量較多,而且定位在上清中。 4.Vγ9Vδ2-pET43.1a的大量表達(dá)和純化。將構(gòu)建好的重組載體Vγ9Vδ2-pET43.1a轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),大量培養(yǎng)后裂解菌體,離心取上清過Ni-NTA純化目的蛋白。此時(shí)的目的蛋白與載體pET43.1a上的標(biāo)簽NusA融合在一起。SDS-PAGE和western證實(shí)已獲得純度較高的Vγ9Vδ2-NusA融合蛋白。 5.Vγ9Vδ2-pET43.1a蛋白的酶切鑒定。將Vγ9Vδ2-NusA融合蛋白通過precission protease酶切分開,并通過Vδ2特異抗體驗(yàn)證酶切結(jié)果。 結(jié)論: 從人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞后直接提取RNA,反轉(zhuǎn)錄后通過PCR即可獲得Vγ9Vδ2 T細(xì)胞受體兩條鏈基因的全長序列。用連接子連接的Vγ9Vδ2重組片段在表達(dá)載體pET43.1a上有較好的表達(dá),并能夠與載體上的標(biāo)簽NusA很好地分離。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2526793