【摘要】：研究背景 隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的變化，冠心病(Coronary HeartDisease, CHD)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，特別是心肌梗死近期和遠期并發(fā)癥不僅威脅人類生命，還嚴重影響人們生活質(zhì)量。雖然，有研究表明心肌梗死發(fā)生后部分心肌細胞有分裂增殖的現(xiàn)象，但僅1%的更新率難以彌補損失的心肌細胞數(shù)量，對心功能的改善作用甚微。目前臨床治療冠心病心梗主要集中于挽救非梗死區(qū)的心肌細胞，改善心功能。但不管是藥物治療還是介入治療，或是外科心臟搭橋手術(shù)都不能恢復梗死區(qū)的心臟功能，所以嚴重心梗的患者死亡率仍然很高。修復梗死區(qū)心肌細胞成為臨床醫(yī)生和醫(yī)學科學家亟待解決的難題。近年來，很多關(guān)于干細胞誘導分化為心肌樣細胞修復梗死區(qū)心肌細胞以改善心臟功能的研究為冠心病的進一步治療帶來希望。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)用于治療冠心病心肌梗死的前臨床研究已經(jīng)取得令人鼓舞的進展，但如何解決誘導分化率低的問題是目前需要突破的瓶頸。隨著研究的深入，干細胞治療冠心病將會為患者帶來良好的獲益。 研究目的 1.探討骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSCs）體外分離培養(yǎng)及純化方法。 2.探索BMP-2誘導骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSCs）分化為心肌樣細胞的實驗方法及效果。 3.探索BMP-2和5-AZA聯(lián)合誘導骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSCs）向心肌樣細胞分化的作用。 研究方法 1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSCs）的體外分離及培養(yǎng)：取大鼠四肢長骨骨髓，采用密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁法分離骨髓內(nèi)的BMMSCs，傳代培養(yǎng)以純化細胞。取第4代BMMSCs用流式細胞儀進行表面抗原CD29、CD44、CD45檢測。倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察細胞生長情況，并拍照記錄。 2. BMP-2誘導BMMSCs向心肌樣細胞分化：取第4代BMMSCs誘導24h后換液。實驗分組為：空白對照組(Control)和BMP-2組(10μg/L)。Western Blot檢測2w和4w縫隙連接蛋白43(CX43)及心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的表達。免疫熒光染色鑒定BMP-2誘導4w后分化為心肌樣細胞的cTn I和CX43表達情況。 3. BMP-2和5-AZA聯(lián)合誘導BMMSCs向心肌樣細胞分化：取第4代BMMSCs進行誘導分化，實驗分組如下：空白對照組(Control)、5-AZA組(10μmol/L)、BMP-2組(10μg/L)、BMP-2+5-AZA組(10μg/L+10μmol/L)。前3組誘導24h后換完全培養(yǎng)液，聯(lián)合誘導組共誘導48h后換完全培養(yǎng)液。誘導終止后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。培養(yǎng)4w后免疫熒光染色鑒定細胞cTnI、CX43蛋白的表達；Western Blot法檢測cTn I、CX43蛋白表達量的變化；流式細胞儀檢測各誘導組MSCs分化為心肌樣細胞的分化率。 研究結(jié)果 1.大鼠BMMSCs體外培養(yǎng)的形態(tài)學特征：原代BMMSCs體積小，胞核較小，形態(tài)多樣，，主要為短梭形，還有橢圓形、星形、不規(guī)則形，有大小、長短不等的突起伸出胞體。1w后細胞呈集落樣成長，排列規(guī)則，可見到漩渦樣結(jié)構(gòu)。傳代后的細胞體積變大，排列不規(guī)則，核漿比變大，形態(tài)不均，排列紊亂。流式細胞儀BMMSCs表面抗原鑒定結(jié)果為：CD29陽性表達率為(94.4±3.59)%，CD44陽性表達率為(88.4±1.51)%，CD45陽性表達率為(2.6±0.40)%。 2. BMP-2誘導BMMSCs向心肌樣細胞分化：倒置相差顯微鏡下Control組細胞無明顯變化；BMP-2組細胞體積及核漿比明顯增大，細胞呈長梭形，生長方向隨著時間延長趨于一致、排列規(guī)則、細胞間連接緊密，4w時細胞出現(xiàn)肌島樣結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色提示：4w時可見BMP-2組細胞cTn I和CX43表達，Control組未見cTn I表達，僅有少量CX43表達。WesternBlot檢測cTn I及CX43蛋白表達水平，2w時BMP-2組cTn I及CX43有少量表達；4w時BMP-2組cTn I及CX43表達增強，明顯高于2w時的表達。 3. BMP-2和5-AZA聯(lián)合誘導BMMSCs向心肌樣細胞分化：流式細胞儀檢測各組誘導終止后活細胞數(shù)百分比，結(jié)果顯示5-AZA組活細胞數(shù)占細胞總數(shù)(45.23±5.73)%，BMP-2組活細胞數(shù)占細胞總數(shù)(73.56±3.78)%,BMP-2+5-AZA組活細胞數(shù)占細胞總數(shù)(68.75±6.82)%。倒置相差顯微鏡下細胞的形態(tài)學變化：除Control組細胞無明顯變化外；各組細胞形態(tài)均明顯變大、呈長梭形，細胞核增大，細胞間聯(lián)系緊密，細胞排列一致、生長趨于集中，4w時形成肌島樣結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色提示：誘導2w時Control組未見cTn I表達，其余3組均可見少量表達；4w時Control組仍未見表達，其余3組cTn I表達均明顯較2w時增強，且聯(lián)合誘導組表達高于5-AZA組和BMP-2組。Western Blot檢測cTnI及CX43蛋白表達水平，2w時Control組微弱表達，其余三組有少量表達；4w時Control組仍表達微弱，其余三組cTn I及CX43表達明顯增強，分別與Control組比較均有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)；聯(lián)合誘導組明顯高于5-AZA組和BMP-2組，組間兩兩比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05)，4w與2w組內(nèi)比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05)。流式細胞儀檢測心肌樣細胞分化率：結(jié)果顯示，空白對照組FITC標記的陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)(2.05±0.39)%；5-AZA組FITC標記的陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)(23.78±1.53)%； BMP-2組FITC標記的陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)(17.53±1.06)%；BMP-2+5-AZA組FITC標記的陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)(27.99±2.01)%。5-AZA組、BMP-2組和BMP-2+5-AZA組與Control組比較均有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。 研究結(jié)論 1. BMP-2和5-AZA聯(lián)合誘導提高BMMSCs分化率達(27.99±2.01)%，且細胞死亡率明顯低于5-AZA單獨誘導組，是一種安全高效的誘導分化方法。 2.BMP-2可以誘導BMMSCs分化為心肌樣細胞并表現(xiàn)相應生物學特征，但分化率為(17.53±1.06)%，效果不優(yōu)于單純5-AZA誘導。 3.采用密度梯度離心與差速貼壁相聯(lián)合的分離方法可以獲得BMMSCs，流式細胞儀檢測第4代BMMSCs表面抗原證實可以獲得高純度BMMSCs。
【圖文】：

圖 1 光學顯微鏡下 BMMSCs 形態(tài)學變化a: 即刻分離的BMMSCs (×100); b: 原代培養(yǎng)3 d的BMMSCs (×100);c: 原代培養(yǎng)7 d的BMMSCs (×100); d: 第4 代BMMSCs (×100).3.2 BMMSCs 聯(lián)合表面抗原鑒定結(jié)果流式細胞儀檢測 BMMSCs 表面陽性抗原 CD29、CD44 和陰性 CD45，結(jié)果顯示：CD29 陽性表達率為(94.4±3.59)%，CD44 陽性表達率為(88.4±1.51)%，CD45 陽性表達率為(2.6±0.40)%。（圖 2）。結(jié)果表明采用密度梯度離心與差速貼壁聯(lián)合法分離獲得大鼠 BMMSCs，經(jīng)傳代培養(yǎng)，可得到純化的 BMMSCs。

-32-圖 2 BMMSCs 表面抗原表達a. BMMSCs 表達 CD29 流式圖 b. BMMSCs 表達 CD44 流式圖；c. BMMSCs 表達 CD45 流式圖 d. BMMSCs 表達 CD29、CD44、CD45 統(tǒng)計圖4 討 論成體組織干細胞有自我更新即再生潛能，在一定條件下可以向多種細胞分化。骨髓間充質(zhì)干細胞在適宜環(huán)境和一定細胞因子存在的條件下可以分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、表皮細胞等。BMMSCs 作為種子細胞移植之前，需要連續(xù)培養(yǎng)多代以獲得足夠量的細胞來修復器官損傷。MSCs 具有多能干細胞共同的特點，廣泛存在于人體的各個器官，如
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：2520641