【摘要】：陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis, TV)是寄生在人體泌尿生殖道系統(tǒng),主要引起女性的滴蟲性陰道炎,男性的尿道炎及不育等癥狀,此外,陰道毛滴蟲還可以引起其他動物如小鼠成為帶蟲者,松鼠猴表現(xiàn)出臨床癥狀,且呈現(xiàn)世界性分布,是一種危害人獸健康的重要人獸共患寄生性原蟲。陰道毛滴蟲病毒(Trichomonas vaginalis Virus, TVV)的發(fā)現(xiàn)為陰道毛滴蟲細胞分子生物學研究開辟了新道路,而本實驗室陰道毛滴蟲病毒載體的構(gòu)建成功使導入外源基因得以實現(xiàn),也為蛋白質(zhì)功能研究提供了新方法。盡管有研究表明陰道毛滴蟲病毒顆粒的感染對陰道毛滴蟲致病性、毒力以及耐藥性等方面均呈現(xiàn)一定影響,但對蟲體蛋白質(zhì)表達上研究尚未見報道,所以本研究首次對陰道毛滴蟲攜病毒與無病毒蟲株之間蛋白表達差異進行比較研究,獲得兩者之間差異蛋白譜。 本試驗應用肝浸湯培養(yǎng)基對陰道毛滴蟲攜病毒與無病毒蟲株進行體外純培養(yǎng),同時為排除病毒顆粒對試驗的影響,利用CsCl密度梯度超速離心提取陰道毛滴蟲病毒顆粒,通過超聲破碎方法提取三者總蛋白進行比較；通過iTRAQ技術,經(jīng)nanoLC分離系統(tǒng)得出的數(shù)據(jù)分析得到陰道毛滴蟲攜病毒與無病毒之間蛋白表達差異；并應用熒光定量PCR技術檢測差異蛋白磷酸丙糖異構(gòu)酶(TVTPI)基因在mRNA水平上差異情況以及利用錘頭狀核酶經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染導入蟲體體內(nèi)后驗證差異蛋白TVTPI的功能。 試驗結(jié)果顯示,陰道毛滴蟲攜病毒與無病毒蟲株之間共鑒定出270種蛋白,其中有50種蛋白存在表達差異,包括多種類型蛋白,而大多在攜病毒蟲株中呈現(xiàn)上調(diào)；熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示差異蛋白TVTPI在]mRNA水平上存在顯著差異,無病毒蟲株的表達量為攜病毒蟲株的58.00%,說明陰道毛滴蟲病毒感染后上調(diào)蟲體TVTPI基因轉(zhuǎn)錄水平表達；同時設計合成了針對于TVTPI基因的的錘頭狀核酶73nt,并連接到陰道毛滴蟲病毒載體上得到pNEO/73nt進行體內(nèi)和體外對TVTPI基因切割研究,體外試驗表明pNEO/73nt體外轉(zhuǎn)錄體對TVTPI體外轉(zhuǎn)錄體起到有效切割作用,切割效率達到82.19%,而同時設計的反義TVTPI片段pNEO/TPI對TVTPI基因體外轉(zhuǎn)錄體的影響作用較小,僅為35.5%,為進行體內(nèi)試驗提供了理論基礎；通過電穿孔轉(zhuǎn)染方法,將pNEO/73nt體外轉(zhuǎn)錄體導入陰道毛滴蟲體內(nèi),熒光定量PCR檢測在體內(nèi)pNEO/73nt對TVTPI基因切割效果為75.20%,蟲體計數(shù)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后蟲體生長情況顯著低于正常水平(P0.01),染色觀察蟲體有輕微的形變,表明磷酸丙糖異構(gòu)酶對蟲體成長起到明顯影響,說明TVTPI是陰道毛滴蟲體內(nèi)一種重要的功能性蛋白。 本試驗為進一步研究陰道毛滴蟲病毒感染對陰道毛滴蟲與宿主的致病機制、耐藥性、毒力等方面影響,及陰道毛滴蟲蛋白質(zhì)組學研究提供理論基礎。
【圖文】：

2.1陰道毛滴蟲無病毒株篩選陰道毛滴蟲兩種蟲株總核酸提取樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，可以看到陰道毛滴蟲無病毒株只有總基因組條帶而無病毒條帶。(見圖1一1)圖1一l:陰道毛滴蟲攜病毒與無病毒株總核酸 F191一 1AgarosegeleletroPhoreticanalysisoftotalnucleicacidfromT，乓刀nalisM:15000markerl:陰道毛滴蟲攜病毒株2:陰道毛滴蟲無病毒株 M:15000markerl:TvaginalisinfeetedwithTI/J尸2:Tvag之naliswithoutT卜 FinfeCt10n2.2陰道毛滴蟲形態(tài)觀察用顯微鏡觀察到培養(yǎng)蟲體12h后，即可在培養(yǎng)基底部看到有蟲體生長;24h后，大量繁殖，數(shù)目可以達到12h的4倍;36h后，蟲體生長呈對數(shù)期，蟲體生長活躍:48h后，，整個培養(yǎng)基中均可以看到蟲體，但活力減弱且培養(yǎng)基底可以看到有死蟲;60h后，蟲體變?yōu)閳A形，活力極度下降;72h后蟲體大量死亡。用瑞氏與姬氏混合液染色可見陰道毛滴蟲呈梨形或橢圓形，位于蟲體前端的細胞核

平衡標簽及氨基酸反應標簽。其中報告標簽基團由四個分別為114、115、116、117Da大小分子量組成，質(zhì)量平衡標簽是由分子量分別為31、30、29、28Da組成(見圖2一2)，而氨基酸反應標簽相同均是由一個相同的多膚反應基團(NHS)組成。反應的基本原理是由NHS和多肚中的氨基端或者和多膚鏈中的賴氨酸殘基上的氨基進行共價反應，進而對多膚進行標記。這樣既可以同時對四個樣本同時進行定量分析，而汀RAQ最大的優(yōu)勢就在于能夠?qū)Φ鞍走M行絕對的定量，合成相應的膚段，使用其中一種標簽進行膚段標記，利用相對定量的結(jié)果，以及合成膚的絕對量來實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的絕對定量。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：S852.7;R382.21

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