【摘要】：蓖麻毒素是存在于蓖麻籽油中的植物毒素。這種毒素由A和B兩個亞基組成，并通過一條二硫鍵連接在一起。蓖麻毒素B亞基是一種半乳糖特異性的凝集素，能夠結(jié)合細(xì)胞表面含糖脂或糖蛋白的受體。這些結(jié)合的毒素隨后通過宿主細(xì)胞依賴的內(nèi)化機(jī)制和從內(nèi)吞小體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逆向運輸機(jī)制被運入細(xì)胞質(zhì)。在進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，蓖麻毒素必須在蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）的作用下，將A，B亞基間的二硫鍵還原，此后A亞基才能露出其酶活性位點。當(dāng)RTA轉(zhuǎn)移到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，它的糖苷酶活性位點能夠識別rRNA上高保守的α-sarcin環(huán)，阻礙多肽延伸并導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。因為其具有高致死和易于散播獲得的特性，蓖麻毒素被認(rèn)為是一種可能被用于生化攻擊的生物戰(zhàn)劑。目前，盡管已經(jīng)有許多中針對這一威脅的治療方法以及被發(fā)展出來，但特異性的抗體治療仍舊是一種最特異和最高效的治療方法。 之前曾經(jīng)有報道稱兩株或更多單克隆抗體的聯(lián)合使用能夠增加抗體的保護(hù)效果，同時，我們在制備抗蓖麻毒素單克隆抗體的過程中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。當(dāng)我們將兩株抗RTA的單克隆抗體6C2和抗RTB的單克隆抗體3E1聯(lián)合使用后，我們發(fā)現(xiàn)抗體的在體內(nèi)和體外的保護(hù)水平都得到了提高。在過去十年中隨著對傳統(tǒng)抗體臨床知識的成熟，人們開始試圖發(fā)展出下一代抗體以期提高抗體的效果。下一代抗體的種類有許多，而雙特異性抗體是其中最受重視的一種。雙特異性抗體一個關(guān)鍵的能力是能夠一個分子同時中和保護(hù)兩個不同的目標(biāo)，例如配體，受體，或細(xì)胞因子。除此之外，雙特異抗體還能通過識別一個抗原分子上的不同表位來增加抗原特異性和保護(hù)效果。 在我們的課題中，我們設(shè)計了一種含有6C2和3E1可變區(qū)和人Fc區(qū)的雙特異性抗體，具有一個臂結(jié)合兩個抗原的能力，我們稱之為DVD抗體。在隨后的工作中，我們證實這種新的DVD抗體保留了親源抗體所有的特性和功能：包括識別RTA和RTB的能力，阻礙RTA酶活性的能力，阻礙RTB結(jié)合細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂的能力。細(xì)胞毒性實驗和小鼠保護(hù)實驗顯示DVD抗體，其保護(hù)作用有明顯的提高：比單個抗體的保護(hù)效果至少多了10倍，甚至比嵌合的6C2和3E1的聯(lián)合使用效果還好了3倍。結(jié)合相同表位的抗體的效果一般被認(rèn)為與抗原抗體之間的親和力有關(guān)。然而，和我們的發(fā)現(xiàn)不同的是，DVD抗體和6C2抗體，3E1抗體的動力學(xué)參數(shù)之間并沒有特別大的差別。所以，在此后的研究中我們合理的質(zhì)疑DVD抗體可能還通過一些其他我們所不知道的機(jī)制保護(hù)機(jī)體免受毒素攻擊。 RICIN發(fā)揮作用的必要條件是細(xì)胞質(zhì)中游離RTA的存在。全毒素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外釋放RTA的過程中，PDI對RTA-RTB間二硫鍵的解離是其關(guān)鍵步驟。DVD和兩株傳統(tǒng)的單克隆抗體之間最大的差別是他能夠用一個抗體臂同時抓住RTA和RTB。隨后，我們在無細(xì)胞體系中用western blot和SRP分析證實了DVD抗體能夠?qū)е骆滈g二硫鍵無法被還原。除此之外，還有一個明顯的證據(jù)就是DVD抗體能夠使RTA在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留，而其他的抗體包括6C2和3E1抗體的聯(lián)合應(yīng)用都不能引起相同結(jié)果�；谝陨辖Y(jié)果，我們認(rèn)為當(dāng)DVD抗體和毒素一起被吸收進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時，二硫鍵被PDI還原的過程被DVD干擾了。這應(yīng)該是DVD抗體動力學(xué)數(shù)據(jù)和單個抗體類似，但保護(hù)效果優(yōu)于其他抗體的合理解釋。
【圖文】：

抗蓖麻毒素雙功AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGK V Y A C E V T H Q G L SACAGGGGAGAGTGTN R G E C單克隆抗體 6C2,3E1 輕重鏈可變區(qū) 5抗體輕重鏈可變區(qū)基因是構(gòu)建嵌合抗體的基，我們采用 5’RACE 法對鼠源單克隆抗體 行了兩輪 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增最終產(chǎn)物大小約1 2 M 3 4

圖 1-2 輕重鏈可變區(qū) T 載體克隆酶切鑒定結(jié)果M：DNA maker II；Lane 1,2：3E1 VL 克��；Lane 3,4：3E1VH 克��；Lane 1,2：6C2VL 克��；Lane3,4：6C2VH 克隆4、3E1，6C2 輕鏈和重鏈可變區(qū)序列測定結(jié)果—500將酶切正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。結(jié)果顯示，6C2 抗體重鏈可變區(qū)全長共有408 個核苷酸，前 57 個編碼前導(dǎo)序列。輕鏈可變區(qū)共有 387 個核苷酸，前 66 個編碼前導(dǎo)序列；3E1 抗體重鏈可變區(qū)全長共有 429 個核苷酸，前 57 個編碼前導(dǎo)序列。輕鏈可變區(qū)共有 381 個核苷酸，，前 60 個編碼前導(dǎo)序列。3E1 重鏈可變區(qū)核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列1 ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAG
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：2519076