【摘要】：蓖麻毒素是存在于蓖麻籽油中的植物毒素。這種毒素由A和B兩個(gè)亞基組成，并通過一條二硫鍵連接在一起。蓖麻毒素B亞基是一種半乳糖特異性的凝集素，能夠結(jié)合細(xì)胞表面含糖脂或糖蛋白的受體。這些結(jié)合的毒素隨后通過宿主細(xì)胞依賴的內(nèi)化機(jī)制和從內(nèi)吞小體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逆向運(yùn)輸機(jī)制被運(yùn)入細(xì)胞質(zhì)。在進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，蓖麻毒素必須在蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）的作用下，將A，B亞基間的二硫鍵還原，此后A亞基才能露出其酶活性位點(diǎn)。當(dāng)RTA轉(zhuǎn)移到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，它的糖苷酶活性位點(diǎn)能夠識(shí)別rRNA上高保守的α-sarcin環(huán)，阻礙多肽延伸并導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。因?yàn)槠渚哂懈咧滤篮鸵子谏⒉カ@得的特性，蓖麻毒素被認(rèn)為是一種可能被用于生化攻擊的生物戰(zhàn)劑。目前，盡管已經(jīng)有許多中針對(duì)這一威脅的治療方法以及被發(fā)展出來，但特異性的抗體治療仍舊是一種最特異和最高效的治療方法。 之前曾經(jīng)有報(bào)道稱兩株或更多單克隆抗體的聯(lián)合使用能夠增加抗體的保護(hù)效果，同時(shí)，我們?cè)谥苽淇贡吐槎舅貑慰寺】贵w的過程中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。當(dāng)我們將兩株抗RTA的單克隆抗體6C2和抗RTB的單克隆抗體3E1聯(lián)合使用后，我們發(fā)現(xiàn)抗體的在體內(nèi)和體外的保護(hù)水平都得到了提高。在過去十年中隨著對(duì)傳統(tǒng)抗體臨床知識(shí)的成熟，人們開始試圖發(fā)展出下一代抗體以期提高抗體的效果。下一代抗體的種類有許多，而雙特異性抗體是其中最受重視的一種。雙特異性抗體一個(gè)關(guān)鍵的能力是能夠一個(gè)分子同時(shí)中和保護(hù)兩個(gè)不同的目標(biāo)，例如配體，受體，或細(xì)胞因子。除此之外，雙特異抗體還能通過識(shí)別一個(gè)抗原分子上的不同表位來增加抗原特異性和保護(hù)效果。 在我們的課題中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種含有6C2和3E1可變區(qū)和人Fc區(qū)的雙特異性抗體，具有一個(gè)臂結(jié)合兩個(gè)抗原的能力，我們稱之為DVD抗體。在隨后的工作中，我們證實(shí)這種新的DVD抗體保留了親源抗體所有的特性和功能：包括識(shí)別RTA和RTB的能力，阻礙RTA酶活性的能力，阻礙RTB結(jié)合細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂的能力。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和小鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示DVD抗體，其保護(hù)作用有明顯的提高：比單個(gè)抗體的保護(hù)效果至少多了10倍，甚至比嵌合的6C2和3E1的聯(lián)合使用效果還好了3倍。結(jié)合相同表位的抗體的效果一般被認(rèn)為與抗原抗體之間的親和力有關(guān)。然而，和我們的發(fā)現(xiàn)不同的是，DVD抗體和6C2抗體，3E1抗體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)之間并沒有特別大的差別。所以，在此后的研究中我們合理的質(zhì)疑DVD抗體可能還通過一些其他我們所不知道的機(jī)制保護(hù)機(jī)體免受毒素攻擊。 RICIN發(fā)揮作用的必要條件是細(xì)胞質(zhì)中游離RTA的存在。全毒素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外釋放RTA的過程中，PDI對(duì)RTA-RTB間二硫鍵的解離是其關(guān)鍵步驟。DVD和兩株傳統(tǒng)的單克隆抗體之間最大的差別是他能夠用一個(gè)抗體臂同時(shí)抓住RTA和RTB。隨后，我們?cè)跓o細(xì)胞體系中用western blot和SRP分析證實(shí)了DVD抗體能夠?qū)е骆滈g二硫鍵無法被還原。除此之外，還有一個(gè)明顯的證據(jù)就是DVD抗體能夠使RTA在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留，而其他的抗體包括6C2和3E1抗體的聯(lián)合應(yīng)用都不能引起相同結(jié)果�；谝陨辖Y(jié)果，我們認(rèn)為當(dāng)DVD抗體和毒素一起被吸收進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)，二硫鍵被PDI還原的過程被DVD干擾了。這應(yīng)該是DVD抗體動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和單個(gè)抗體類似，但保護(hù)效果優(yōu)于其他抗體的合理解釋。
【圖文】：

抗蓖麻毒素雙功AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGK V Y A C E V T H Q G L SACAGGGGAGAGTGTN R G E C單克隆抗體 6C2,3E1 輕重鏈可變區(qū) 5抗體輕重鏈可變區(qū)基因是構(gòu)建嵌合抗體的基，我們采用 5’RACE 法對(duì)鼠源單克隆抗體 行了兩輪 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增最終產(chǎn)物大小約1 2 M 3 4

圖 1-2 輕重鏈可變區(qū) T 載體克隆酶切鑒定結(jié)果M：DNA maker II；Lane 1,2：3E1 VL 克��；Lane 3,4：3E1VH 克隆；Lane 1,2：6C2VL 克�。籐ane3,4：6C2VH 克隆4、3E1，6C2 輕鏈和重鏈可變區(qū)序列測(cè)定結(jié)果—500將酶切正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果顯示，6C2 抗體重鏈可變區(qū)全長(zhǎng)共有408 個(gè)核苷酸，前 57 個(gè)編碼前導(dǎo)序列。輕鏈可變區(qū)共有 387 個(gè)核苷酸，前 66 個(gè)編碼前導(dǎo)序列；3E1 抗體重鏈可變區(qū)全長(zhǎng)共有 429 個(gè)核苷酸，前 57 個(gè)編碼前導(dǎo)序列。輕鏈可變區(qū)共有 381 個(gè)核苷酸，，前 60 個(gè)編碼前導(dǎo)序列。3E1 重鏈可變區(qū)核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列1 ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAG
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2519076