【摘要】：背景與目的 間充質干細胞[mesenchymal stem cells，MSCs]是干細胞家族的重要成員，具有自我更新和多向分化潛能。胎盤源間充質干細胞（Placenta-derived mesenchymal stemcells, PMSCs）具有來源豐富，無倫理學問題，獲取較為方便，且表型與骨髓源MSCs（BMSCs）表達相似，正日漸受人關注。MSCs具有低免疫原性和獨特的免疫調節(jié)作用，，在自身免疫性疾病及組織修復、器官移植等領域具有廣闊的臨床應用前景。但其具體的免疫調節(jié)作用及機制仍有待澄清。 近年來，BMSCs對于T細胞的免疫調節(jié)研究較多，但對B細胞的免疫調節(jié)作用仍不明確，不同的研究者觀點不一，而在PMSCs對B細胞的免疫調節(jié)研究領域更是鮮見報道。本研究在體外分離培養(yǎng)獲得PMSCs的基礎上，就PMSCs對同種異體B淋巴細胞的增殖、活化及相關細胞表面協(xié)同刺激分子表達的影響進行初步研究，探討PMSCs對B淋巴細胞的免疫調節(jié)作用，為進一步臨床應用提供實驗依據(jù)。 方法 從人胎盤組織中分離培養(yǎng)獲得形態(tài)均一的貼壁細胞，通過檢測細胞表面抗原表達、分化潛能等特征進行鑒定，確定所得細胞為間充質干細胞。用CpG2006、重組人CD40L、人IL-2、人IL-4和IgM+IgG(H+G)等(縮寫為CpG)激發(fā)B細胞，并將其與體外擴增培養(yǎng)的用絲裂霉素處理的PMSCs按5:1的數(shù)量共培養(yǎng)，并與PMSCs培養(yǎng)上清組和未激發(fā)組等進行對照，具體細胞分組為：（1）未激發(fā)組（B）；（2）：CpG等激發(fā)組（CpG+B）；（3）：激發(fā)B淋巴細胞與PMSCs共培養(yǎng)組（B+CpG+PMSCs）；（4）：激發(fā)B淋巴細胞與PMSCs培養(yǎng)上清共培養(yǎng)組（B+CpG+PMSCs(sup)）；（5）：未激發(fā)B淋巴細胞與PMSCs共培養(yǎng)組（B+PMSCs）；（6）未激發(fā)B淋巴細胞與PMSCs培養(yǎng)上清共培養(yǎng)組（B+PMSCs(sup)）；（7）：對照組（PMSCs）。所有細胞培養(yǎng)72小時后，用免疫熒光標記、流式細胞術檢測B細胞增殖及表面正性及負性協(xié)同刺激分子CD80、CD86、PD-L1的表達。 結果 1、PMSCs具有MSCs特性的細胞形態(tài)和表面標志，表達CD29、CD44、CD105、CD43、CD90、CD106、CD166，不表達CD34、CD45和HLA-DR。 2、PMSCs不表達協(xié)同刺激分子CD80、CD86、CD83、PD-1和B7H4，但高表達PD-L1。 3、PMSCs可分化為脂肪細胞，光鏡下可見細胞質中脂滴形成，油紅0染色陽性；并可分化為成骨細胞，von Kossa法染色可見黑色的鈣沉積。 4、CpG2006、重組人CD40L、人IL-2、人IL-4和IgM+IgG(H+G)等激發(fā)B細胞24小時后出現(xiàn)活化細胞團， B+CpG+PMSCs組活化細胞團更大，而B+CpG+PMSCs(sup)組活化細胞團較小，未激發(fā)組均未出現(xiàn)活化細胞團。 5、標記細胞增殖的核抗原Ki67在B+CpG+PMSCs（41.60±13.81）%組比B+CpG組（19.23±2.79）%表達明顯增高，而B+CpG+PMSCs(sup)組（16.00±1.57）%較B+CpG組（19.23±2.79）%表達低，各組間比較有統(tǒng)計學意義。 6、正性協(xié)同刺激分子CD86在B+CpG+PMSCs(sup)組（4.21±1.10）%與B+CpG組（3.89±0.43）%間無明顯差異。兩組CD86的表達都比B+CpG+PMSCs組（10.87±1.86）%低，有統(tǒng)計意義。 7、正性協(xié)同刺激分子CD80在未激發(fā)組的表達較低，為(17.33±9.60)%，在B+CpG組為（51.17±6.53）%、B+CpG+PMSCs組為（49.37±19.45）%和B+CpG+PMSCs(sup)組為（54.74±13.59）%，其表達均高于未激發(fā)組，但三者之間無明顯統(tǒng)計學差別 8、負性協(xié)同刺激分子PD-L1在未激發(fā)組B淋巴細胞的表達為（3.24±0.25）%，B+CpG組（37.80±3.30）%，B+CpG+PMSCs組（37.85%±6.65），B+CpG+PMSCs(sup)組（32.65±5.65）%，刺激物激活的三組PD-L1的表達均較高，但三者之間無明顯統(tǒng)計學差異。 結論 1、胎盤組織間充質干細胞來源豐富，PMSCs具有與BMSCs相似的免疫表型、多向分化能力。 2、PMSCs在一定情況下，能促進B淋巴細胞的活化和增殖，這種促進作用可能與細胞間的直接接觸有關。 3、PMSCs促進活化B淋巴細胞增殖的機制可能與表面協(xié)同刺激分子CD86有關，可能并不通過協(xié)同刺激分子PD-L1和CD80信號途徑介導。
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圖片說明： 細胞生長變快，約一周可再次傳代。PMSCs可以在體外穩(wěn)定傳代，且10代以后其增殖速度無明顯減慢。圖1 胎盤間充質干細胞（PMSCs）的形態(tài)及生長情況，倒置顯微鏡觀察并拍照。（A）：PMSCs原代培養(yǎng)7d（40X）；（B）：PMSCs第1代培養(yǎng)2d（40X）；PMSCs第3代培養(yǎng)6d（40X）；（D）：PMSCs第3代培養(yǎng)6d（100X）。
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圖片說明： PMSCs 表面協(xié)同刺激分子的表達情況。PMSCs 不表達協(xié)同刺激分子 CD80、CD86、CD83、PD-1 和 B7H4，但高表達 PD-L1（圖 2B）。圖2A 流式細胞術檢測PMSCs細胞表面抗原的表達圖2B 流式細胞術檢測PMSCs細胞表面協(xié)同刺激分子的表達
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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